吡罗红、甲基绿与核酸染色反应实验探究

2019-09-14郝连振王红蕊

生物学通报 2019年11期

敖兰郝连振王红蕊

（1 保定市第一中学河北保定 071000 2 石家庄第十五中学河北石家庄 050000）

人教版生物必修1《分子与细胞》中，第2 章“组成细胞的分子”第3 节安排了一个实验——“观察DNA 和RNA 在细胞中的分布”。该实验实现了从初中宏观、个体层面的教学到高中微观、分子水平的教学转折，但在实际教学中该实验的开出率及成功率都不尽人意。本文在大量实验探究的基础上，进行了4 个方面的改进：降低药品浓度、改变药品配方和实验类型、简化操作步骤、更换实验材料，从而使实验现象更清晰，更易于学生操作，成功率更高。

1 改进原因

该实验源自大学生物学专业（尤其是医学专业）的一个常规实验——“Brachet（布拉奇特）反应”，吡罗红和甲基绿的混合染液称为“Unna（温纳）”试剂。该方法出现于1901年，Unna［1］在1910年又对试剂进行了改良，使实验效果更加明显，所以这是个成熟的实验。自2004年选入高中生物学教材以来，有关该实验改进的文章也频频出现，但对该实验在高中阶段的开展都没有实质性的影响。

1.1 教材描述不清楚教材是这样表述的：“吡罗红甲基绿染色剂取A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色剂，使用时现用现配。A 液：取吡罗红甲基绿粉1 g，加入100 mL 蒸馏水中溶解，放入棕色瓶备用。”这段描述只说吡罗红甲基绿粉1 g，没说明吡罗红甲基绿的比例，而通常购买的是分装的吡罗红粉和甲基绿粉。

1.2 实验费用偏高以上海Regal Biotechnology Company提供的报价来看，该实验所需的2 种药品的价格分别为：5 g 吡罗红370 元、10 g 甲基绿178 元，这2 种药品在高中生物学常规实验中是费用最高的。按照教材配方，假定吡罗红甲基绿的比例是1∶1，A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色剂，每瓶吡罗红（5 g）和甲基绿（10 g）能配5 000 mL溶液。现阶段高中生物学实验室通常是按照28 组配备，按每年级20 个班计算，有的学校购买一次药品只能做1～2 次学生实验。

1.3 实验效果不能保证选取该实验时，完全按照大学教材中的操作方法引进。而大学一般是按照制作玻片标本的步骤进行操作。玻片标本制作步骤如下：取材、固定、冲洗、染色、脱水、透明、封片，每步都有相应的时间，步骤不能简化、时间不能缩短、浓度不能降低，否则其制作的标本达不到最佳的观察效果且不能长期保存［2］。大学的实验课通常都是按照半天时间安排，可按照操作步骤进行，实验效果也不会出问题，而高中实验课只有40 min 或45 min，时间有限，无法保证实验的效果。

2 改进方案

2.1 降低药品浓度针对多数学校出现染色较深，细胞核呈现红色而不是绿色的情况，笔者尝试降低药品的浓度。利用梯度法，甲基绿从2%开始降低浓度进行配制，吡罗红从5%开始降低浓度进行实验，最终确定染色效果最佳的最小浓度为：甲基绿0.03%，吡罗红0.03%。从而减少了染料使用量，降低了实验成本。

2.2 改变药品配方 Brachet 反应主要是利用核酸分子上的磷酸根（-PO43-）和碱性染料形成盐键而在原位沉淀显色，DNA 和RNA 都有磷酸根（-PO43-），故能同时和碱性染料结合。由于DNA 分子和RNA 分子的聚合程度有差别，Unna 试剂中的甲基绿优先和DNA 分子相结合，而吡罗红更多地与RNA 分子相结合，从而表现出不同的颜色，显示细胞内RNA 与DNA 的分布位置［3］。

然而笔者按照有些资料介绍的吡罗红甲基绿比例进行操作，细胞核和细胞质都呈现红色，没有体现甲基绿的颜色。因此改变了2 种染料的使用比例，分别按照吡罗红∶甲基绿为3∶1、2∶1、1∶1 的比例操作，最终确定当比例为1∶1 时，能观察到清晰的绿色的细胞核。

2.3 简化操作步骤教材以口腔上皮细胞为实验材料，但口腔上皮细胞在显微镜下数量少、体积小、染色不充分，从而不易观察。于是笔者用洋葱内表皮细胞作为实验材料，省略了针对口腔上皮细胞进行的烘干操作。

其次，由于该反应对酸碱度敏感，而缓水流冲洗不能彻底去除盐酸，因此尝试将材料直接放在染液中进行染色，结果现象更加清晰，从而去掉水解和缓水流冲洗2 个步骤。这样实验步骤从6 个减少为3 个，即为制片、染色、观察，极大节省了时间，有利于学生在有限时间内对实验进行思考和讨论。

2.4 改变实验类型在该实验中，为何要用吡罗红和甲基绿混合染剂染色，而不是先用一种染剂再用另一种染剂染色？也是一个重要的考点。为了让学生通过探究理解这一问题，笔者改变了实验类型，将观察实验改为探究实验。将实验分为4组：分别用甲基绿染剂、吡罗红染剂、甲基绿和吡罗红混合液（体积比1∶1）和加入pH=4.8 缓冲液的甲基绿吡罗红混合液对洋葱表皮细胞进行染色观察。

3 改进后的实验操作

实验试剂：0.03%甲基绿染液，0.03%吡罗红染液（甲基绿粉和吡罗红粉均购买自上海Regal Biot-echnology Company，2009年生产），pH=4.8 缓冲液（以下染液浓度均为0.03%，不再重复说明）。

实验用具：数码显微镜、普通显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、镊子等。

实验材料：洋葱内表皮。

实验时间：40 min。

实验步骤：①制片。

表1 实验分组

取2 个载玻片，第1 个载玻片的左、右2 个位置分别滴加1、2 组染液各1 滴,第2 个载玻片的左、右2 个位置分别滴加3、4 组染液各1 滴；在每种试剂里分别加入洋葱内表皮并用镊子展开（如果先将洋葱内表皮展开在载玻片上，其易因干燥而卷在一起；如果将洋葱内表皮先用清水湿润，则会改变试剂浓度）；盖上盖玻片并用吸水纸吸去多余试剂。

②观察。制好装片后，即可进行观察；数码显微镜用于在前台为学生展示理想的实验效果，并比较分析4 组实验现象。

4 实验结果

在40 倍物镜下，观察得到如图1～图4（本文附图见封四）所示图像。由于简化了实验步骤，改变了实验类型，学生在有限的一节课的时间里，能更充分地进行思考讨论。以下是遵循对照原则，进行的实验结果分析：①通过1、2 组对照，学生强化了对甲基绿和吡罗红都能使DNA、RNA 染色的认识；②通过1、2、3 组对照，学生得出甲基绿和吡罗红与核酸的结合程度有差异； ③通过3、4 组对照，学生得出该颜色反应对酸碱度敏感的结论。