一株西藏牦牛源肠球菌的分离鉴定

孔新平，周 磊，王汉鼎，吴庆侠，董海龙

（西藏农牧学院，西藏 林芝 860000）

肠球菌属细菌为G+球菌，常成对或短链，肠球菌属有粪肠球菌、屎肠球菌等19种。作为人和动物肠道的正常菌群，一般情况下肠球菌并不引起疾病，但在人或动物机体抵抗能力不强的情况下，它就会成为条件致病菌引起人或动物机体患病。此外，由于肠球菌的固有耐药性以及因人类对抗生素的滥用获得性耐药性的产生，肠球菌对于抗生素的耐药情况愈发严重[1]。本次试验对从西藏山南地区采集到病死牦牛肝脏上分离到的试验菌株进行细菌分离鉴定耐药性检测，将为西藏自治区细菌耐药性检测以及山南地区牦牛养殖和临床用药提供一定指导。同时，本次试验利用枯草芽孢杆菌替代传统抗生素来治疗粪肠球菌导致的腹泻，将为解决粪肠球菌临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 对西藏山南地区一头病死牦牛进行尸体剖检，无菌采集牦牛肝脏放入密封袋中，置于冰盒后迅速送往试验室，-20℃冰箱保存待检。

1.1.2 主要试剂 营养肉汤、普通琼脂、麦康凯培养基、绵羊血液、生化鉴定管（购自杭州滨河微生物试剂公司）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、细菌基因组DNA提取试剂盒、50×TAE、Maker、核酸染料（购自武汉擎科创新生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱、摇床、烘箱、超净工作台、PCR仪、凝胶成像系统、普通光学显微镜、电泳仪。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离 将病料充分研磨后离心，采集上清接种于普通营养肉汤，37℃摇床80r/min培养24 h。勾取菌液划线接种于5%血琼脂平板，37℃恒温培养箱培养24 h。勾取典型单菌落再次接种于营养肉汤，37℃摇床80r/min培养24 h后进行革兰氏染色镜检。将菌液划线接种于普通琼脂平板和麦康凯培养基进行纯化，将典型单菌落接种于肉汤培养24 h后，50%甘油菌液以1：1的比例保菌，并将该菌株命名为BYP。

1.2.2 生化鉴定 用移液枪吸取纯化后菌液20 ul接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、硫化氢、枸橼酸盐、硝酸盐（还原）生化鉴定管，37℃培养24 h后观察颜色变化对结果进行判定。

1.2.3 PCR鉴定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌模板DNA，保存于-20℃；使用细菌16S rRNA通用性引物，27F-/1492R（合成自武汉擎科创新科技公司）。PCR反应体系为25ul，其中2×Es Taq MasterMix（Dye）12.5ul、上游引物1ul、下游引物1ul、细菌模板DNA 1ul、ddH2O 9.5ul配足体系；反应条件：94℃预变性1min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸5 min[3]。

PCR扩增结束之后将产物产物于1%琼脂糖中进行琼脂凝胶电泳，之后于凝胶成像系统300 nm下观察电泳情况并采集图片。

1.2.4 DNA序列分析 PCR扩增产物送往武汉生工网点进行双向测通，测序拼接结果经BLAST进行比对，并使用MegAlign软件将测序结果与GenBank下载序列进行同源性分析，并用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.5 药敏试验 吸取200 ul细菌24 h纯培养菌液移到普通琼脂上面，并使用无菌涂布棒将菌液涂布均匀，最后弃去多余菌液，使用无菌镊子夹取药敏纸片贴于平皿中，轻轻下压药敏纸片，同时注意药敏纸片之间的距离适当，培养基在37℃恒温培养箱培养24 h后，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，依据药敏试验标准对药敏结果进行判定[2]。

1.2.6 动物试验 从林芝市农贸市场购置健康家兔4只，将其随机分成2组，一组为试验组，一组为对照组。正常饲喂一段时间，周期为两周。在此期间，保持兔舍卫生状况、通风良好，饲料、饮水充足。两周之后，将肠球菌BYP经37℃恒温摇床培养8h后的菌液对4只家兔进行腹腔注射，菌液浓度为2.7×109cfu/ml，5 ml/只，1次/d，连续注射4d[5]。在四只兔子出现腹泻现象时，对试验组家兔灌服试验室保存的一株耐酸耐胆盐的枯草芽孢杆菌[7]，灌服剂量均为20 ml/只，1次/d，连续给药7d。对照组家兔不予处理。在此期间应及时对兔子进行观察并记录。

2 结果

2.1 细菌的分离培养

初次将增殖后的菌液划线接种于5%血琼脂平板后有轻微溶血现象；在麦康凯培养基上可形成粉红色小菌落；在5%血清琼脂平板上生长良好。革兰氏染色镜检可见蓝紫色革兰氏阳性球菌，常成对，也可见单个分布或链状排列，无芽孢（图1）。

图1 细菌镜检结果（100×10）

2.2 生化试验结果

生化试验结果显示，该菌株能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖，甘露醇，硫化氢、枸橼酸盐、硝酸盐（还原）均呈阴性（表1）。

表1 细菌生化试验结果

2.3 PCR鉴定

PCR扩增产物经1%琼脂凝胶电泳后，于凝胶成像系统300nm下对图像进行扫描，可以清楚看到16S rDNA扩增产物为1.5kb左右的条带，于预期片段大小结果相符（图2），说明细菌的16S rDNA序列被成功扩增[4]。

图2 BYP 16S rDNA PCR产物电泳结果

2.4 DNA序列分析

此次16S rDNA PCR扩增产物测序方式为双向测通，测序结果出来后使用chromas软件对序列进行拼接，拼接后序列长度为1 464 bp，与预期相符，使用MegAlign将序列进行同源性分析，如图3所示，菌株BYP与登录号为NR_113257、NR_113900、NR_036922、NR_075022、NR_113574、NR_113256、NR_037082、NR_114742、NR_114452的序列的同源性均在99.0%以上，可以认定它们为同一物种，即可以确定菌株BYP属于肠球菌属[4]。同时由图4所构建的菌株BYP的系统发育树可以看出，所分离到的肠球菌BYP与登录号为NR_075022的菌株属同一支，即亲缘关系最近。

图3 BYP 16S rDNA基因序列同源性

图4 BYP 16S rDNA序列系统进化树

表2 西藏牦牛源肠球菌药物敏感性试验结果

2.5 药敏试验结果

通过测量抑菌圈直径大小并依据CNSL标准进行判定，发现该菌株对庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、红霉素、万古霉素表现出敏感，对氨苄西林、苯唑西林表现出耐药（表2）。

2.6 动物试验

对家兔进行腹腔注射肠球菌4天后，四只家兔均出现腹泻现象，精神沉郁、食欲寡欢、被毛粗乱。对照组兔子不予处理，七天后均死亡，死后对其进行尸体剖检，发现其肠道出现充血现象，肠系膜一扯就破，肝脏轻微肿大，形体极度消瘦。试验组兔子灌服枯草芽孢杆菌后，渐渐好转，腹泻现象消失恢复健康。说明枯草芽孢杆菌对于治疗肠球菌所导致的家兔腹泻有治疗效果[6]。

3 讨论与分析

本次试验通过对从西藏山南地区病死牦牛肝脏中分离到的一株病原菌进行生化鉴定，16S rDNA进行测序，证明所分离到该株病原菌为属于肠球菌属。但是由于屎肠球菌菌群各种细菌16S rDNA序列同源性处于98.7%～99.7%之间，所以BYP属于何种还需通过种特异性引物的PCR实验进行确定[7]。

药敏试验结果显示该菌株对，对氨苄西林、苯唑西林表现出固有耐药性，而对庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、红霉素、万古霉素表现出敏感。在此试验中，尽管肠球菌对庆大霉素和卡那霉素十分敏感，但在临床上无效。除非做氨基糖苷类药物的高浓度筛选。

近年来随着抗生素的滥用以及细菌之间耐药基因转移，西藏地区细菌耐药性情况日益加重[8]，探求细菌耐药机制以及解决方法成为热点，因而寻找出一种防止细菌产生耐药性的治疗方法变得尤为重要。而益生菌就成为了一种好的选择。本次动物试验中对健康家兔使用BYP进行攻毒试验使其腹泻，再使用一株耐酸耐胆盐的枯草芽孢杆菌替代抗生素来治疗家兔腹泻，治疗效果良好。证明枯草芽孢杆菌在一定程度上可以作为临床上抗生素的替代品。这就避免了由于使用抗生素或可能产生的耐药性问题，为今后肠球菌治疗提供了新思路。