HPLC法测定皮革及皮革制品中防霉剂吡啶硫铜锌含量

杨艺欢

(广东省惠州市质量计量监督检测所 轻化室，广东 惠州 516000)

皮革因富含蛋白质，是微生物生长的天然培养基。因此，皮革的防腐防霉工艺一直深受重视。目前最常用的方法是添加防腐防霉剂，如甲醛、酰胺类、季铵盐类和杂环类化合物等[1]。吡啶硫铜锌(ZPT)作为一种高效的广谱杀菌剂应用广泛，因其高效、低毒、使用安全等性质被广泛应用于各行各业中[2]。但近年来有研究表明，长期接触ZPT易诱发人体过敏性、接触性皮炎，对人体健康及生态环境造成一定压力。国内外关于吡硫鎓锌的检测方法主要是关于化妆品中的去屑成分，在国家食品药品监督管理总局组织完成的《化妆品安全技术规范》(2015年版)中规定淋洗类产品中限量要求为1.5%。目前，国内外都没有针对皮革及皮革制品中ZPT含量检测的标准，因此有必要建立一种针对性强、灵敏度高、回收率高、快速的检测方法。

1 实验部分

1.1 测定原理

在酸性条件下，样品经正己烷脱脂后，用甲醇超声提取，经高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，根据保留时间和光谱图定性，峰面积定量，以标准曲线法计算ZPT含量。

1.2 主要实验仪器

高效液相色谱 (美国安捷伦公司)；超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；IQ7000纯水机(美国Milli-Q公司)。

1.3 试剂

吡啶硫铜锌标准品(纯度>99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；甲醇(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；乙腈(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；实验用水为二级蒸馏超纯水。

标准溶液的配制：准确称取0.03000g标准物质于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即配成浓度为600μg/mL标准溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.8mm×250 mm,5μm)；

流动相：甲醇，加入0.05mmol/L的EDTA，用磷酸调节至pH值至4.0～4.5之间；

检测器：二极管阵列检测器；

波长：340nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

1.5 样品前处理

脱脂：将皮革或皮革制品剪成小于5mm×5mm的碎片后，准确称取1.000g，加入20mL正己烷，于40℃超声波中提取30min，倒掉正己烷，重复上述步骤一次，脱脂后敞口放置过夜，挥干正己烷。

萃取：往提取器中准确加入10.0mL甲醇，旋紧盖子，在40℃超声波中提取30min，冷却至室温，经0.22μm滤膜过滤，试液供测定用。

2 结果与分析

2.1 样品处理的优化

皮革及皮革制品的主要组成包括蛋白质、纤维、无机盐、油脂等，结构紧密，不溶于水，这些基质的存在不但会干扰ZPT的提取，而且容易污染仪器。因此，在目标物提取时需先进行纯化。甲醇和乙腈能使少量蛋白质沉淀，但由于乙腈的极性小于甲醇，在反相中洗脱能力要强于甲醇，因ZPT本身的出峰时间较早，因此用甲醇作溶剂更合适。通过超声提取目标物后，经0.22μm滤膜过滤后上机测定。该方法操作简单，回收率高，灵敏度高，满足定性和定量要求。

本方法探讨了脱脂对目标物提取的影响。本实验对以下两种情况进行分析，分别是样品先经正己烷脱脂再用甲醇提取，与样品直接用甲醇进行提取。实验证明，前者比后者出峰杂质要少，这说明脱脂处理对目标物质的提纯具有良好的效果。

本方法探讨了流动相的选择对分析结果的影响。实验证明，当流动相的pH值为6.0～7.0时，ZPT出现异常峰-双峰；当调节流动相的pH值为4.0～4.5时，峰形虽得到一定的改善，但仍有拖尾和双峰现象。在流动相中加入比例为0.05mmol/L的EDTA，且pH值调节为4.0～4.5时，色谱峰形尖锐、对称，柱效大大提高。这说明在酸性条件下，在流动相中加入一定比例的EDTA，目标物分析效果良好。

2.2 线性范围与检出限

逐级稀释配备标准溶液7个点，经测定，标准溶液在(3～120)μg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数r2=0.999。以不含ZPT的牛皮作为本底，当添加浓度为1μg/mL时，信噪比S/N=67.7>3。结果表明，设定最低检出限1μg/mL符合要求。

2.3 精密度实验

对一个样品重复测定7次，通过峰面积计算平均值、标准偏差和相对标准偏差(RSD)。本实验测定的RSD<5%，实验证明该方法的流动相及色谱条件的选择对目标物的测定具有良好的分析效果。精密度数据如表1所示。

表1 精密度测试测定结果Table1 The precision data

2.4 回收率试验

表2 加标回收率试验结果Table 2 The recovery data

选取不含ZPT的牛皮作为本底，添加3个水平的加标回收试验，每个水平进行2次平行测定，测定数据见表2。试验结果表明，回收率均大于85%，表明本实验的前处理方法能对目标物起到很好的提纯作用。

2.5 实际样品检测

随机抽取20份皮革或皮革制品，按照本研究建立的方法进行检测ZPT含量。其中1份样品检出少量ZPT，其余19份样品未检出。经分析，阳性样品的光谱图匹配度为977，色谱图和光谱图如图1所示。

图1 阳性样品色谱图与光谱图Fig.3 Chromatogram and spectra of positive sample

3 结论

本试验建立了外标法定量，高效液相色谱法测定皮革及皮革制品中防霉剂吡啶硫铜锌含量。样品用正己烷脱脂，用甲醇作为提取后，经HPLC-DAD检测。该方法的检出限为1μg/mL，定量下限为3 μg/mL，线性范围(3～120) μg/mL，相关系数为r2=0.999。该方法前处理简单方便，灵敏度高，回收率较高，分析时间短，适合大批量样品的快速检测。