石上柏中双黄酮对DPPH自由基的清除作用研究

2019-09-13朱田密陈树和张金亮陈科力

山东化工 2019年16期

朱田密，陈树和，张金亮，陈科力

(1.湖北省中医院药事部，湖北武汉 430061；2.湖北省中医药研究院中药研究所，湖北武汉 430074；3.武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，湖北武汉 430223；4.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065)

石上柏是卷柏科卷柏属植物深绿卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的全草，为临床常用中药，具有清热，除湿，解毒的功效；主治咽喉肿痛，目赤肿痛，肺热咳嗽，湿热黄疸，风湿痹痛[1]。临床中还治疗妇科等疾患。石上柏化学成分含有生物碱类和黄酮类等，其中所含有的双黄酮类是卷柏科以及某些裸子植物的特征化学成分[2]。这类成分具有抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，降血糖等活性[3-6]。Wang G等从深绿卷柏的乙酸乙酯部位检测到9种具有抗氧化效果的双黄酮[7]。而纯化后的总双黄酮的抗氧化活性尚未见报道。笔者对石上柏中的总双黄酮进行提取纯化，并分析组成，测试抗氧化活性。DPPH是一种稳定的氮中心的自由基，广泛用于评价各种合成的或天然的抗氧化剂对自由基的直接清除作用[8]。本研究利用DPPH自由基清除法评价石上柏中双黄酮类的抗氧化活性。

1 仪器与试药

ES225SM-DR电子天平(瑞士普利赛斯公司)，4000 Q TRAP液质联用仪(美国AB Sciex公司)，SPECORD plus210紫外可见分光光度计(德国耶拿分析仪器股份公司)，XW-80A微型旋涡混合仪(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)。

石上柏中药饮片(湖北辰美中药有限公司，产地湖北)，经笔者鉴定为石上柏即深绿卷柏Selaginella doederleinii Hieron.的干燥全草，样品留存于湖北省中医院中药研究所标本室；抗坏血酸(L-Ascorbic acid，美国Sigma公司)；DPPH自由基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，美国Sigma公司)；聚酰胺粉(武汉药科新技术开发有限公司)；Sephadex LH-20(北京慧德易科技有限责任公司)；无水乙醇，三氯甲烷，甲醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 双黄酮的提取与成分分析

取40g石上柏中药饮片用90%乙醇500mL回流提取5次，过滤，浓缩，干燥，得干膏。干膏经聚酰胺柱色谱(30～60目)，40%～80%乙醇洗脱，浓缩得双黄酮粗品；再经过Sephadex LH-20凝胶色谱，三氯甲烷-甲醇洗脱，洗脱液浓缩后得黄色粉末状双黄酮结晶120mg。采用HPLC-MS对样品进行分析，结合参考文献[7]，检测到该双黄酮混合物由穗花杉双黄酮(539.2[M+H]+)，罗波斯塔双黄酮(539.2[M+H]+)，7-去甲基银杏双黄酮(553.2[M+H]+)，罗波斯塔-4' -甲醚(553.2[M+H]+)，罗汉松双黄酮A(553.2[M+H]+)组成。

2.2 双黄酮的抗氧化活性测试

取石上柏双黄酮混合结晶5.23mg溶解于25mL无水乙醇，稀释得6种不同浓度的样品溶液(0.0026～0.2092mg/mL)。另配制浓度为0.05mg/mL的DPPH·无水乙醇溶液，以及6种不同浓度的抗坏血酸对照组溶液(0.0029～0.2312 mg/mL)。分别取1.0mL样品溶液或对照溶液与2.0mLDPPH·溶液加入4mL塑料离心管中，涡旋混匀，避光反应20分钟，用紫外波长516nm测量吸光度，每个样品测三次取平均值。DPPH·清除率用下式计算[7]。I(%)=[(Ab-As)/Ab]×100%，Ab是空白样品吸光度，As是反应液吸光度。实验得到石上柏中双黄酮与对照组抗坏血酸对DPPH·清除率的结果见图1。由图可知，石上柏中双黄酮对DPPH·的清除率随其浓度的增加而增大，实验浓度范围内，石上柏中双黄酮对DPPH·的最大清除率为8.0%，而抗坏血酸为95.5%。