基于整合药理学的经典名方当归补血汤防治糖尿病的作用机制研究

张倩韬，侯敏娜，彭修娟，杜 蓓，蔡 洁，刘 峰，3

(陕西国际商贸学院 1. 医药学院、2. 中药研究院，陕西 西安 712046；3. 陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075)

经典名方当归补血汤源于《内外伤辨惑论》(金·李东垣)，由君药黄芪和臣药当归5 ∶1组成，是益气养阴名方[1]。糖尿病(diabetes mellitus, DM)属中医“消渴症”的范畴[2]，主要发病机制为先天不足、七情失调、劳欲过度致阴虚燥热，阴虚易产生内热，热灼更伤津液，津伤气血，运行不通，血液在脉管中运行瘀滞。现代研究认为，DM是由于胰岛素分泌绝对不足或胰岛素抵抗引起的糖、脂肪、蛋白质、水和电解质代谢紊乱的代谢性疾病群，以高血糖为主要标志，随着病情的迁延，容易出现心脑血管病变、DM肾病、神经病变、DM足等并发症。大量临床研究表明，当归补血汤对DM及其并发症的疗效明显[3]，能全面改善该病症的多个指标，延缓并发症的发生，且药物不良反应较少[4]。

“2017中国Ⅱ型糖尿病防治指南”指出，我国成年人Ⅱ型DM的发病率已高达10.9%，呈发病年轻化及逐年上升趋势，已成为最常见的慢性病之一[5]。中医药治疗“消渴症”已有上千年的历史，然而，中药方剂药效物质基础难以阐明，药理机制难以说清，服用剂量难以明确，长期应用的安全性评价等诸多问题，严重制约了经典名方的深入研发。这就使得中药防治DM药效物质基础的发现和作用机制的阐明，成为了当前亟待解决的问题。中药整合药理学平台(integrative pharmacology of traditional Chinese medicine, TCMIP)是基于大数据和多学科交叉思维，在方剂、中药材、中药成分、疾病/症状靶标4个数据库基础上，构建“药物成分-作用靶标-疾病通路”互相作用的网络关系，预测中药及其方剂的药效物质基础、作用机制、药理效应等[6]。本研究借助TCMIP平台，探讨当归补血汤防治DM及其并发症的药效物质基础和作用机制，以期为当归补血汤药效物质基础的辨识、制剂质量的评价、作用机制的阐明及其在DM的中药防治中提供有益指导。

1 方法

1.1 当归补血汤的化学成分来源在TCMIP的“中药材数据库”中，添加“黄芪”、“当归”，建立当归补血汤的化学成分数据库。

1.2 候选靶标来源及其靶标预测在TCMIP的“疾病靶标信息设定”中，以“diabetes”为关键词，检索疾病/症状的靶标，作为DM的已知疾病靶标；在“中药靶标预测”界面中，选取药物相似性分数≥0.7的化学成分预测的靶标当做候选靶标来源，相似性药物作用的靶标即为当归补血汤潜在的作用靶标。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用信息TCMIP整合了8个现有数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)数据资源，分别为Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database、Reactome、Online Predicted Human Interaction Database、InAct、Human Protein reference Database、Molecular Interaction Database、Database of Interacting Protein和PDZBase。通过TCMIP的PPI数据库，即可获得当归补血汤作用靶标与DM疾病靶标之间的PPI信息。

1.4 网络构建与分析通过TCMIP的网络分析模块，针对当归补血汤潜在药靶与DM靶标之间的PPI计算网络拓扑特征值，以“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值，选取中药方剂靶标-疾病基因相互作用网络的核心节点(hubs)；在此基础上，以“degree”、“节点紧密度(closeness)”和“节点介度(betweenness)”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为中药方剂矫正疾病失衡网络的关键靶标网络。最后，对关键靶标网络进行通路富集，选取P-Value值前30的关键通路，构建“中药材-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病关键病理环节”的多层次关联网络，从而揭示当归补血汤的作用机制和药效物质基础。

1.5 基因功能和通路富集分析TCMIP镶嵌了基因本体(Gene Ontology, GO)数据库和京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路数据库的资源，对关键靶标的基因和通路富集分析，选择P-Value值前20的关键通路信息列于表中。

2 结果

2.1 当归补血汤化学成分及其预测靶标分析基于TCMIP平台，黄芪收集到29个化学成分，主要为黄芪皂苷类、黄芪苷类、黄酮类等；当归收集到65个化学成分，主要为挥发油类(如藁本内酯、正丁烯内酯、归酮、异丁香酚)、有机酸类(阿魏酸)、当归内酯类等。黄芪的29个成分预测出796个药物靶标，当归的65个成分预测出774个药物靶标。

采用“1.2”的方法，选取药物相似性分数≥0.7的化学成分预测靶标，作为当归补血汤潜在的作用靶标。当归和黄芪两药共有靶标分析结果显示，黄芪的潜在药靶有399个，当归的潜在药靶有396个，且黄芪与当归间共有作用靶标高达208个，说明黄芪和当归间有很强的协同叠加作用。

2.2 当归补血汤候选靶标基因功能及所参与的通路分析对当归补血汤的潜在药靶进行GO分析，所得分析结果中，选择P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 1中。Tab 1是当归补血汤候选靶标基因所参与的生物学功能信息。由Tab 1可知，当归补血汤候选靶标基因主要参与了机体的氢离子跨膜转运、氧化还原过程、线粒体电子转运、前体代谢物和能量生成、维生素代谢、化学突触传递等生物学过程；在细胞组分方面，主要存在于线粒体、线粒体内膜、线粒体基质等组分当中；在分子功能方面，主要介导了谷氨酸门控离子通道活性、离子型谷氨酸受体信号通路及谷氨酸受体信号通路、天门冬氨酸-谷氨酸受体活性及谷氨酸受体的活性、CYP450酶活性、辅酶Q活性等分子生物学过程。

Tab 1 The functional information of Danggui Buxue decoction candidate target

同时，对当归补血汤潜在药靶进行KEGG通路富集分析，所得分析结果中，选择P-Value值前20的关键通路信息列于Tab 2中。Tab 2是当归补血汤候选靶标基因组所参与的生物学调控通路信息。由Tab 2可知，当归补血汤候选药靶主要参与了内分泌及代谢疾病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、心肌收缩、非酒精性脂肪肝、帕金森病、神经退行性疾病、药物上瘾等疾病过程，以及谷氨酸能神经突触、辅酶和维生素的代谢、能量代谢、氧化磷酸化、叶酸的一碳单位、氨基酸代谢等代谢途径。

Tab 2 The pathway information of Danggui Buxue decoction candidate target

2.3 当归补血汤防治糖尿病的核心靶标网络、基因功能和通路富集分析

2.3.1当归补血汤防治DM的核心靶标网络 通过TCMIP的网络分析模块，采用“1.3”和“1.4”所示方法，建立当归补血汤药靶与DM靶标的PPI网络，筛选得到202个关键靶标，其中药物直接作用靶标86个，已知的疾病靶标10个，疾病与药物间的共有靶标3个，其他间接靶标101个。根据Degree值仅显示前100个靶标的PPI网络，红色代表药物直接作用靶标，黄色代表已知的疾病靶标，绿色代表药物与疾病间共有靶标，见Fig 1，图中节点大小与Degree值成正比。

药物作用靶点的主要来源是疾病靶点，由Fig 1可知，当归补血汤与DM间的共有靶标有3个，分别为精氨酸加压素受体(arginine vasopressin receptor，AVPR)的3个亚型：AVPR1A、AVPR1B和AVPR2。AVPR在体内分布广泛，与机体的血压调节、心脏活动，血糖代谢、血栓形成、肾脏的水盐代谢、炎症反应和大脑学习记忆等过程密切相关[7]。有研究表明，AVPR基因缺陷，是导致肾性糖尿病(以烦渴、多饮、多尿及低比重尿为主要临床表现)的重要原因[8]，推测当归补血汤对DM及其并发症的防治作用可能与AVPR介导的心血管-肾脏系统作用有关。

Fig 1 Network of Danggui Buxue decoction candidate targets for diabetes

Red: Putative drug target; Yellow: Known disease target; Green: Common target; Gray: Others.

中药方剂可通过保护胰岛β细胞、调节血糖血脂代谢异常、改善胰岛素抵抗、抑制炎症反应[9]与氧化应激[10]等环节，来发挥防治DM的作用。研究发现，当归补血汤能降低血糖，明显改善DM的“三多一少”症状[11]，及其心血管系统[12]、肾脏、周围神经病变、眼睛病变等并发症。张莹雯等[13]研究表明，当归补血汤可抑制肾皮质转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达，改善肾功能，延缓DM肾病病理进展；周肖等[14]运用当归补血方加减对气虚血瘀型糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)患者进行为期4周的三阴交、涌泉敷贴治疗，结果表明，当归补血方穴位敷贴能够改善气虚血瘀型DPN患者肢体疼痛、肢体麻木、手足畏寒、倦怠乏力等不适症状，并改善气虚血瘀型DPN患者的感觉功能。郭艺娟等[15]研究表明，当归补血汤加味通过降低DM大鼠血-视网膜屏障的渗漏，对DM视网膜早期病变有防治作用，其作用机制可能是抑制NF-κB的激活。

2.3.2当归补血汤防治DM的GO基因功能及KEGG通路富集分析 基于TCMIP的疾病靶标信息，采用“1.5”的方法，对DM靶标进行GO分析，选择P-Value值前20的主要基因功能信息列于Tab 3中。Tab 3是DM靶标基因所参与的生物学功能信息。由Tab 3可知，参与DM病理过程的基因主要分布于细胞质基质、线粒体及线粒体内膜等细胞器，通过调控机体细胞的凋亡和增殖，参与了ATP结合、蛋白激酶活化、腺苷酸环化酶激活、蛋白质磷酸化、氨基酸磷酸化、血小板激活、脂肪酸β氧化、线粒体电子转运、G蛋白偶联受体信号通路等多条信号通路的转导，把细胞外的信号传入细胞内，进而影响疾病的发生、发展。

Tab 3 The target functional information of Danggui Buxue decoction on diabetes

基于TCMIP的疾病靶标信息，采用“1.5”的方法，对DM靶标进行KEGG通路富集分析，选择P-Value值前20的关键通路信息列于Tab 4中。Tab 4是DM靶标基因组所参与的生物学调控通路信息。由Tab 4可知，参与DM病理过程的通路主要集中在内分泌系统、细胞间隙连接、激素信号通路、神经系统、循环系统、长期的抑郁，长期应激状态、谷氨酸能突触、昼夜节律等多条信号通路，以及神经退行性疾病、前列腺癌、乙型肝炎、神经胶质瘤、阿尔茨海默病、亨廷顿病等疾病相关通路。中医将DM划分为脾瘅和消瘅两种类型，全程分为郁、热、虚、损4个阶段。郁阶段多见于DM前期，热阶段多见于DM早期，虚阶段多见于DM中期，损阶段多见于DM晚期。当归补血汤可根据消渴症不同阶段的核心病机进行分型论治，从而达到多途径、多层次、多靶点、多环节干预DM及其并发症的作用。

Tab 4 The target pathway information of Danggui Buxue decoction on the diabetes

2.4 当归补血汤防治糖尿病的“中药-核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系分析基于Fig 1当归补血汤药靶与DM疾病靶标的PPI网络信息，采用“1.3”和“1.4”的方法，构建了当归补血汤防治DM的“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图，见Fig 2(绿色表示中药材，紫色表示化学成分，蓝色表示药物靶标，红色表示疾病通路)。由Fig 2可知，当归补血汤的50个核心“黄芪-当归”化学成分，通过直接或间接作用于60个关键药靶，这些药靶作用于神经-内分泌系统、细胞间连接、激素信号通路、心血管循环系统等30条主要调控通路，来纠正DM及其并发症的疾病失衡网络。黄芪的29个化学成分中有22个参与了DM的防治，主要为三萜环黄氏醇、熊竹素、乙酰黄芪苷I、黄芪皂苷I～黄芪皂苷Ⅷ、膜荚黄芪苷Ⅰ、膜荚黄芪苷Ⅱ、异黄芪苷Ⅰ、异黄芪苷Ⅱ、绵毛黄芪皂苷Ⅸ等；当归的65个化学成分中有28个参与了DM的防治，主要为阿魏酸、茴香酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、琥珀酸、癸二酸、壬二酸、二十四烷酸等有机酸，β-甜没药烯、甲基苯酚、乙基苯酚、二羟基苯乙酮、香草醛等油性成分，豆甾醇-β-D-葡萄糖苷、伞形花内酯、东莨菪素等。可见黄芪为该方中发挥防治DM作用的核心中药，也体现了当归补血汤方重用黄芪的科学性和合理性。

Fig 2 The “compound-target-pathway” network of Danggui Buxue decoction

Green: Traditional Chinese medicine; Purple: Compound; Blue: Target; Red: Pathway.

3 讨论

本研究采用整合药理学方法，对经典名方当归补血汤防治DM的作用机制和药效物质基础进行了预测分析。预测过程中收集了方剂-病症的化学结构数据、基因组学数据、蛋白组学数据及PPI交互网络数据等，以便更合理的研究开发经典名方当归补血汤。

TCMIP预测结果表明，主要有50个“黄芪-当归”化学成分，通过直接或间接作用相关靶标和通路，来纠正DM及其并发症的疾病失衡网络。在G0基因功能信息方面，预测结果表明，当归补血汤通过直接或间接作用于线粒体、线粒体内膜及细胞质基质等细胞器，通过介导多种离子通道活性、酶活性及受体信号通路，影响跨膜转运作用，在物质转运、电子转运、物质代谢和能量代谢过程中起作用。在KEGG调控通路方面，预测结果表明，当归补血汤主要参与了DM的谷氨酸能突触传递、氧化磷酸化、辅酶和维生素的代谢、能量代谢，氨基酸代谢等代谢途径，以及内分泌系统、细胞间隙连接、激素信号通路、神经系统、循环系统、长期应激状态等多条信号转导通路，也参与了DM引发的神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝和心肌收缩等并发症。

在GO基因功能信息和KEGG调控通路的基础上，通过TCMIP的PPI数据资源，筛选到疾病与药物间的共有靶标为AVPR1A、AVPR1B和AVPR2，该受体在体内分布广泛，参与了机体的血压调节、心脏活动，血糖代谢、血栓形成、肾脏的水盐代谢、炎症反应和大脑的学习记忆等众多生命活动。推测当归补血汤对DM及其并发症的作用机制可能是通过AVPR受体信号通路来发挥的。本研究是基于TCMIP所做的预测分析，当归补血汤防治DM的药效物质基础及作用机制还需通过实验研究加以验证。望本研究能够为经典名方当归补血汤的深入研究开发及中药方剂对DM及其并发症的防治提供一些新思路，进而为DM的中药防治提供更多的临床选择。

(致谢：本研究是在中国中医科学院中药研究所提供的中药整合药理学平台完成的，感谢该研究所的许海玉博士在研究过程中给予的指导和帮助。)