介导缺氧诱导因子-1α表达的相关信号通路在类风湿性关节炎中的研究进展

孙明慧，吴 虹，卜妍红，张 衡，戴学静，王 言，占 翔

(安徽中医药大学药学院，新安医学教育部重点实验室，中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的、以慢性滑膜炎症为临床表征的自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜组织异常炎性增生、血管新生、血管翳形成、关节软骨和骨的不可逆性破坏，甚至引发畸形病变以及严重的并发症[1]。迄今为止，RA病因尚未明确，但已有研究表明，缺氧微环境作为RA滑膜炎症组织的重要特征之一，参与调节滑膜炎症反应、血管新生和软骨破坏等关键病理生理过程[2]。

缺氧能促进炎性因子的释放，加重炎症反应；反之，炎症也能加重组织缺氧。缺氧诱导因子1α (hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是调节细胞对缺氧反应的核转录因子，在缺氧微环境中，HIF-1α水平明显上升，并调节胞内许多基因的转录与表达。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最具特征性的HIF-1α下游靶基因之一，缺氧导致HIF-1α积累，并触发HIF-1α和VEGF途径的正反馈调节，促使血管生成以改善机体低氧环境，而降低HIF-1α水平可通过VEGF依赖机制抑制血管生成[3-4]。HIF-1α还参与诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌，调控RA成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)的迁移和侵袭机制，阻断HIF-1α表达可抑制缺氧诱导的RA-FLSs迁移和侵袭，改善滑膜增生及软骨和骨破坏[4-5]。

随着细胞信号转导通路地深入研究，越来越多RA病理调节机制被发现。目前，除氧感受器通路脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)-HIFs-pVHL外，已发现调控HIF-1α表达的信号通路还包括PI3K/Akt、Ras-Raf-MEK-ERK、JAK/STAT、NF-κB等，这些细胞信号转导通路中的效应蛋白有望成为治疗RA潜在的作用靶点。鉴于HIF-1α对RA病情的推动作用，笔者对调控HIF-1α表达的信号通路进行综述，以期从改善病情角度为RA治疗及抗RA新药研发提供思路。

1 PHDs/HIF-1α/pVHL通路

PHDs属于氧依赖性羟化酶，包括3个亚型：PHD1～3，其活性随着细胞内氧含量的变化而变化，对HIF-1α的稳定性调控起关键作用。HIF-1α含有1个氧依赖性的降解结构域(oxygen dependent degradation domain，ODDD)，在常氧条件下，该结构域中的脯氨酸残基Pro402和Pro564极易被氧敏感的PHDs羟基化，并与肿瘤抑制蛋白pVHL结合，聚集多种泛素蛋白(ubiquitin，Ub)，组成泛素蛋白酶复合体，HIF-1α被蛋白酶体快速降解。除PHDs之外，天冬酰胺羟化酶作为HIF-1抑制因子(factor-inhibiting HIF-1，FIH-1)，可将HIF-1α亚基C-末端反式激活结构域(transactivation domain，TAD)中的天冬酰胺残基Asn803羟基化，干扰其与辅因子p300/CBP的结合。在低氧条件下，PHDs和FIH-1活性迅速降低，导致HIF-1α在细胞质中降解受阻，并大量聚集、积累并活化，继而转移至细胞核内，与结构亚基HIF-1β及辅因子p300/CBP发生聚合，形成HIF-1α复合物。该复合物与特定的DNA序列结合，进而与靶基因上的缺氧反应元件(hypoxia-responsive elements，HREs)结合，调控下游靶基因的激活和转录。缺氧引起的氧感受通路的异常活化，在RA病程中发挥重要作用(Fig 1)[6]。

在RA关节缺氧环境中，氧依赖性羟化酶在FLSs中短暂沉默，进而上调HIF-1α的水平，诱导许多促血管生成因子和炎症介质的表达。Muz等[7]发现，沉默PHD1或FIH-1后，HIF-1α水平无影响，而沉默PHD2可增强HIF-1α的稳定性，诱导下游多种靶基因的表达(包括促血管生成基因等)，表明PHD2是调节RA-FLSs中PHDs/HIF-1α/pVHL通路的关键参与者。对比缺氧条件下HIF-1α与促血管生成基因的表达水平发现，PHD2沉默引起的变化与缺氧条件非常相似，意味着PHD2的缺失可以模拟缺氧环境，但在正常滑膜细胞中，沉默PHD2不影响HIF-1α的稳定性，其具体调控机制仍需进一步研究。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)属于富含半胱氨酸生长因子家族的一员，其作为一种炎性介质在RA中高表达，CTGF的水平与VEGF表达呈正相关。进一步研究发现，CTGF可通过上调microRNA-210的水平，抑制甘油-3-磷酸脱氢酶1样蛋白(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like，GPD1L)表达，导致PHD活性降低，HIF-1α积累，进而上调VEGF mRNA水平及VEGF的表达，促进血管生成[8]。

Fig 1 Mechanism of PHDs/HIF-1α/pVHL signaling

Under normoxic conditions, PHDs and FIH hydroxylate different sites of HIF-1α, respectively, producing pVHL binding sites, blocking the combination with cofactor p300/CBP, and resulting in HIF-1α degradation. Under hypoxic conditions, the activity of PHDs and FIH decreased, HIF-1α accumulates and migrates into the nucleus to form a complex with HIF-1β and p300/CBP. The complex combines with HRE to induce target gene transcription, and then regulates cell proliferation, migration/invasion, apoptosis and angiogenesis.

2 PI3K/Akt信号转导通路

磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，属于胞内磷脂酰肌醇激酶，是细胞中重要的信号调节蛋白，其同时具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K分为结构与功能各异的3型，其中I型PI3K研究最广泛，由催化亚基p110和调节亚基p85构成。Akt作为PI3K下游主要的效应分子之一，也是一类特异性的Ser/Thr蛋白激酶。PI3K/Akt信号转导通路在滑膜细胞增殖和凋亡失衡中发挥关键作用，其异常活化引起滑膜过度增生并向软骨和骨组织浸润生长，诱导血管新生及血管翳形成，导致关节畸形和骨破坏[9-10]。

许多信号蛋白分子和信号传导复合物都能启始PI3K的激活过程，诱发磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol diphosphate，PIP2)磷酸化，产生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)，PIP3与存在PH结构域的蛋白激酶Akt相互作用，导致Akt构型改变，形成Ser473和Thr308的磷酸化位点，并移位至细胞膜。同样存在PH结构域的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1，PDK1)与哺乳动物雷帕霉素靶复合体2(mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2)分别将Akt上的Ser473和Thr308位点磷酸化，致使Akt被激活(Fig 2)。

哺乳动物雷帕霉素靶向蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt信号通路的下游效应分子之一。张晓军等[11]采用弗氏完全佐剂建立佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，采用ELISA法检测大鼠血清中HIF-1α、VEGF的表达，Western blot检测滑膜组织PI3K、Akt1、p-Akt1、mTOR蛋白表达情况发现，与正常组比较，模型组血清VEGF、HIF-1α和滑膜组织PI3K、Akt1、p-Akt1、mTOR表达明显升高，表明活化的PI3K/Akt/mTOR信号转导途径可能参与诱导滑膜血管新生。Zhang等[12]探讨低氧条件下RA-FLSs活性、细胞凋亡和侵袭性的影响发现，与常氧细胞相比，缺氧RA-FLSs侵袭性明显增强，且其侵袭能力与HIF-1α表达水平呈正相关。曲古抑菌素A可明显抑制缺氧诱导RA-FLSs的活力，诱导细胞凋亡，阻断RA-FLSs侵袭，并降低MMP-2、MMP-9的表达。进一步对其作用机制进行探究发现，这些作用通过下调PI3K活性，进而抑制Akt活化实现，而活性Akt的过表达可逆转其对RA-FLSs侵袭性及MMP-2、MMP-9下调的抑制作用，表明缺氧诱导的RA-FLSs中的促凋亡与抗侵袭活性与PI3K/Akt信号转导的激活有关。

3 Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路

作为MAPKs的一个亚族，胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)包括5个亚型，即ERK1～ERK5，其中对ERK1/2研究最为广泛。在炎性环境中，许多细胞因子参与启始Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路，通过一系列复杂过程被细胞表面受体和胞内传感机制活化，参与多种生物学反应。ERK的异常活化除介导RA中细胞增殖和炎症反应之外，还参与调控血管生成、软骨及骨破坏等过程，导致RA病情不断恶化[13]。

多数信号因子对ERK1/2的活化都始于对Ras的激活，Ras是信号传递的“分子开关”，其被激活后作用于Raf的氨基末端，使Raf从胞质移位至细胞膜上，通过丝/苏氨酸残基磷酸化而活化。Raf激活后，其C端催化区可与MEK结合，并使两个丝氨酸磷酸化，进而激活MEK，随后通过酪氨酸和苏氨酸双特异性磷酸化激活ERK，形成Ras/Raf/MEK/ERK途径(Fig 2)。

研究证实，炎症因子、生长因子和某些细胞因子受体均可激活ERK信号转导通路，B细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)属于肿瘤坏死因子超家族成员之一，在B细胞的成熟和维持中起作用，且BAFF与自身免疫疾病密切相关。Lee等[14]探究了TNF-α诱导的BAFF表达对RA-FLSs和人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A存活的影响，通过使用BAFF siRNA转染细胞，证实BAFF表达与细胞存活率呈正相关。常氧条件下，TNF-α诱导的MH7A细胞BAFF、VEGF和HIF-1α的转录及表达可被HIF-1α siRNA阻断；缺氧条件下或过表达HIF-1α时，HIF-1α siRNA阻断作用被逆转。进一步研究发现，ERK抑制剂PD98059抑制TNF-α诱导的BAFF表达，而HIF-1α的过表达可使PD98059抑制作用被逆转，表明TNF-α通过ERK依赖的HIF-1α表达来调控FLSs的存活。ERK的激活还参与调节血管新生，来源于三七叶片的三七皂苷Ft1可通过激活ERK信号通路，诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、迁移，诱导管形成。对其具体机制探究发现，Ft1刺激Raf/MEK/ERK途径磷酸化，促进HIF-1α从胞质向胞核的转运及HIF-1α与VEGF启动子的结合，上调VEGF mRNA的转录水平及VEGF的分泌。Ft1也参与调控PI3K/Akt/mTOR途径磷酸化。进一步研究发现，mTOR及其效应器核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70S6K)是PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK的下游靶点，沉默mTOR致使Ft1的促血管生成作用被抑制，表明PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK通路均通过下游mTOR/P70S6K途径，调控HIF-1α的活化及VEGF的转录与表达[15]。

Fig 2 Mechanism of signaling pathways regulating HIF-1α mRNA and protein expression

Inflammatory factors activate PI3K and induce PIP3production. Under the effect of PKD1 and mTORC2, Akt is phosphorylated and activated. After inflammatory factors stimulated Ras, Raf/MEK phosphorylate and finally activate ERK. Both activated Akt and ERK can phosphorylate mTOR and activate its effector protein p70S6K, increasing the translation level of HIF-1α.

Inflammatory factors bind to its receptors on the membrane and then activate the JAK/STAT signaling pathway. The activated STAT proteins are translocated into the nucleus to bind to the target genes in the form of a dimer, thus affecting the synthesis of HIF-1α mRNA. Inflammatory factors activate IKK which degrades IκB, and resulting in activated NF-κB releases. Activated NF-κB transports into the nucleus and binds to target gene, finally induces the synthesis of HIF-1α mRNA.

4 JAK/STAT信号转导通路

JAK属于典型的非跨膜酪氨酸激酶，JAK家族由4个成员组成，分别是JAK1-JAK3以及Tyk2，其可使与其相结合的细胞因子受体磷酸化，它还能够使含有SH2结构域的蛋白分子发生磷酸化反应。STAT被称为“信号转导子和转录激活子”，目前为止已发现STAT家族的7个成员，STAT蛋白包含6个功能区段，其中SH2结构域是最重要的功能区段，可与细胞因子受体酪氨酸磷酸化特异性结合。目前，大量的研究表明JAK/STAT信号通路功能失调可诱导RA-FLSs增殖，导致滑膜增生；调节免疫反应，造成滑膜炎症；调控靶基因MMPs的分泌，加重软骨及骨破坏[16]。

JAK-STAT信号转导通路通常由诸多细胞因子激活，介导细胞多种生物学功能，在免疫调节和炎症反应过程中发挥关键作用。首先，信号分子作用于相应的受体后，与受体偶合的JAK激酶发生酪氨酸磷酸化作用并被活化。然后，活化的JAK促使受体发生磷酸化修饰，产生酪氨酸磷酸化位点；同时，含有SH2结构域的STAT蛋白被募集至该位点，经JAK催化磷酸化修饰后，磷酸化的STAT蛋白以二聚体形式移位至细胞核内，与靶基因结合并诱导其转录与翻译(Fig 2)。

为探讨低氧对RA中STAT3诱导的促炎途径的影响，甄晓洲等[17]通过建立低氧诱导的THP-1细胞的炎症模型发现，低氧可促进炎症因子IL-18、TNF-α的分泌，并提高细胞内p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达。JAK2抑制剂AG490能明显抑制低氧诱导的p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达，降低促炎因子IL-18、TNF-α的分泌。即低氧可能通过激活JAK2/STAT3信号通路，诱导细胞炎症因子的表达增加，加重炎症反应。Gao等[18]研究发现，缺氧诱导滑膜组织HIF-1α与p-STAT1/3的表达，并促进p-STAT3核易位，该效应可被STAT3 siRNA和JAK2抑制剂WP1066阻断；且缺氧诱导的细胞侵袭、迁移和细胞因子产生受到STAT3 siRNA和WP1066的抑制。HIF-1α siRNA可降低缺氧诱导的p-STAT3水平，STAT3 siRNA也能抑制缺氧诱导的HIF-1α表达水平，表明在RA促炎机制的调节中，HIF-1α和STAT3信号之间存在功能联系；在体外RA滑膜移植培养中，JAK2抑制剂明显降低IL-6、IL-8和MMP3的自分泌，并诱导IL-10表达，进一步证实STAT阻断在RA治疗中的作用。目前，JAK/STAT信号途径对RA中HIF-1α表达的研究尚不多见，但在许多癌症发病机制中已进行了深入探讨，JAK/STAT信号途径的激活是通过上调HIF-1α mRNA及其蛋白的表达，抑制癌细胞凋亡、促进肿瘤血管新生以及癌细胞侵袭和转移等过程。所以我们有理由推断，在RA中，JAK/STAT信号途径亦能调控HIF-1α mRNA的表达，该机制具体途径有待进一步研究。

5 NF-κB信号转导通路

NF-κB是哺乳动物中一类关键的转录激活因子，NF-κB家族由NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB和cRel组成，其N端均存在Rel同源区，可与DNA结合，并特异性识别DNA碱基序列；RelA(p65)、c-Rel和RelB三者C端存在反式激活结构域，能独立诱导基因表达。NF-κB常以p65/p50二聚体形式存在。NF-κB的活化可诱导炎性介质持续作用，在细胞分化、凋亡、黏附、炎症及免疫应答等方面影响RA的发生、发展[19]。

静息状态时，抑制蛋白IκB可通过其C端特定的锚蛋白重复序列结合，并封闭NF-κB蛋白的核定位区域(nuclear-localization sequence，NLS)，抑制NF-κB的活性。在经典途径中，NF-κB的活性受IκB激酶(IκB kinase, IKK)的控制，该激酶介导IκB磷酸化并降解，诱导NF-κB的核转位(Fig 2)。缺氧对RA-FLSs中NF-κB活化的影响机制尚不清楚，但在其他细胞的研究中发现，常氧条件下，IKK可被PHDs羟基化失活，抑制NF-κB的活化；在缺氧条件下，PHDs对IKK的羟化活性降低，导致IκB磷酸化并降解，进而缓解NF-κB的抑制作用[20]。

炎症可激活NF-κB信号转导途径，进而上调多种促炎因子释放，导致慢性、持续性的炎症反应，进而加重滑膜炎症，促进软骨和骨破坏以及血管翳生成。Trebec-Reynolds等[21]发现，经NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)处理后，巨型破骨细胞中HIF-1α mRNA及蛋白表达增加，VEGF-A表达水平升高。二甲基双酚A作为有效的HIF-1α抑制剂，可明显降低巨型破骨细胞中的VEGF-A蛋白水平；NF-κB抑制剂胶酶毒素明显抑制RANKL诱导的HIF-1α mRNA及蛋白表达，表明RANKL通过激活NF-κB途径，提高HIF-1α mRNA及蛋白水平，高水平的HIF-1α促进VEGF表达，进而促进血管新生和骨重建循环，加重RA病情。高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)是一种由滑膜组织中多种免疫细胞和滑膜细胞共同释放的促炎介质，Park等[22]发现，HMGB1可增强RA患者关节滑膜细胞中HIF-1α mRNA的转录水平和活性，并刺激VEGF的表达；用抗HMGB1抗体干预其作用可抑制血管新生，并降低HIF-1α的表达，降低HIF-1α水平可抑制HMGB1诱导的VEGF表达。进一步研究发现，HMGB1受体TLR4参与HMGB1诱导的HIF-1α表达，且与NF-κB的转录活性有关，抗TLR4抗体明显抑制HMGB1诱导的NF-κB p65的活性，抑制NF-κB激活可阻断HMGB1依赖的HIF-1α mRNA的表达及其活性的上调，提示NF-κB调控参与了HIF-1α基因的转录与表达。

6 其他信号转导通路

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子CSL(CBF-1, Suppressor of hairless, Lag)蛋白三部分组成。Notch信号的产生通常来源于相邻细胞Notch配体与受体的相互作用，继而释放出有活性的Notch蛋白NICD(Notch intracellular domain, 又称ICN)，NICD易位至细胞核内与CSL蛋白相结合，并招募核转录激活蛋白家族MAML(mastermind-like)，继而形成三元络合转录复合物，其作用于Notch信号通路的相应靶点基因，发挥多种生物学作用。Gao等[23]研究发现，Notch配体DLL4、Jagged-1与NICD在RA滑膜组织中表达增加，且滑膜组织氧含量与患者滑膜组织中NICD的表达呈负相关；Notch抑制剂DAPT可以抑制HIF-1α的表达及活化，进而抑制血管新生。缺氧条件下，Notch-1还与STAT3信号之间存在功能联系，缺氧诱导的Notch-1IC、DLL4和靶基因HRT-1、HRT-2的表达均可被JAK2抑制剂WP1066抑制，即通过阻断STAT信号传导，抑制Notch信号途径的激活，进而调节RA促炎机制，达到治疗RA的目的[18]。

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是一种生物活性脂质，由鞘氨醇(sphingosin，Sph)经鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SphKs)磷酸化产生，可与细胞膜表面G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族成员S1P受体(S1P receptors，S1PRs)结合，S1PRs通过调节相关炎症信号通路，影响新生血管的形成[24]。Sassoli等[25]对骨髓间充质基质细胞研究发现，S1P/S1PR1介导缺氧状态下MMP-2与HIF-1α的表达，S1PR1拮抗剂降低HIF-1α表达及其核定位，表明S1PR1介导的信号传导可能维持HIF-1α在缺氧条件下的表达及活性。

7 展望

通过对介导HIF-1α表达的相关信号通路的调研发现，HIF-1α水平及其介导的促炎、促血管新生等作用是一个受多机制、多信号通路调控的过程，且各通路之间相互交错，关联错综复杂。通过调节介导HIF-1α表达的多种信号途径，可为RA治疗提供新的方向。目前，已研究发现多种信号通路抑制剂如托法替尼(JAK抑制剂)、替西罗莫司(mTOR抑制剂)、贝伐单抗(抗VEGF抗体)等，参与抑制细胞增殖和存活，抑制炎症反应、血管生成、炎性细胞浸润和关节损伤等过程[20]。因此，从信号通路途径深入研究RA的发病机制，发掘信号通路中的关键环节和关键因子，并筛选其特异性阻滞剂阻断信号传递，以期为RA治疗和抗RA新药的研发开拓新思路。