板桥党参通过PP2A信号通路改善AD模型大鼠认知功能障碍

谌 勤，罗洪斌, 2, 3，谢文执

(湖北民族大学1. 医学部生物化学与分子生物学教研室、2. 科技学院生物化学与分子生物学教研室、3. 神经精神共患病研究所，湖北 恩施 445000)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的老年痴呆症，临床主要表现为记忆力、计算能力及定向能力障碍。老年斑(senile plaque，SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)、胆碱能系统功能失调、突触受损及神经元缺失[1]为其主要病理改变。Tau蛋白磷酸化假说认为[2]，在AD患者的临床早期即发生其大脑内Tau被过度磷酸化修饰(其磷酸化水平高于正常人的3～4倍)，导致Tau与微管蛋白的结合能力下降，并引起该蛋白从微管中脱落，进而影响中枢神经细胞发育、轴突运输及突触间信息的传递。脱落的过度磷酸化Tau会互相聚集形成NFTs，并具有明显的神经毒性，且磷酸化修饰程度与AD患者的痴呆程度呈正相关[3]。大量研究表明，蛋白磷酸酯酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A) 能使过度磷酸化修饰的Tau发生去磷酸化修饰，并恢复Tau的正常微管组装能力，而PP2A活性的下降会导致AD的特征性病理改变[4-5]。冈田酸(okadaic acid，OA)是PP2A的特异性抑制剂，大鼠脑海马注射OA后可明显下调PP2A活性，并诱导Tau发生过度磷酸化修饰，进而导致大鼠空间学习记忆障碍[6]。因此，以PP2A为靶点的AD药物研究策略，可为该病的治疗带来新的希望。

板桥党参(BanqiaoCodonopisisPilosula，BCP)为桔梗科党参，属川党参中的小条党参，因主产于恩施州板桥镇，故简称“板党”，为恩施州道地药材，具有补气补血活血之功效。现代药理研究表明，BCP临床疗效确切，在增强免疫力、活血、抗氧化、延缓衰老等方面具有重要的药理作用[7-9]。BCP还可通过糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)信号通路，改善AD模型大鼠的学习记忆能力，恢复海马受损神经元功能，促进神经发育[10]。但AD发病机制中除GSK-3β信号通路外，PP2A信号通路也发挥了重要作用，查阅文献暂未发现BCP能作用于此信号通路。故有必要探讨BCP对PP2A信号通路的影响，可为中药防治AD提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂按60 kg成人为标准，给予BCP低、中、高用药剂量分别为15、30、60 g·kg-1·d-1，大鼠按250 g为标准，相当于成人的临床等效的低、中、高剂量分别为0.54、1.08、2.16 g·kg-1·d-1。换算方法根据《药理实验中动物间和动物和人体间的等效剂量换算》计算获得[11]。BCP水煎液制备方法：称量432 g BCP切片，煎取3次，合并滤液，浓缩定量至2.16 kg·L-1备用。OA购自美国Millipore公司；pT231、pS396、pS404、pT181、p307-PP2Ac抗体，购自美国SAB公司；DM-PP2Ac抗体，购自美国Santa Cruz公司；Tau-5、PP2Ac、M-PP2Ac抗体，购自美国Abcam公司；甲酯酶(PME)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NMDAR1)、突触素(Synaptophysin)抗体，购自美国Millipore公司；NMDAR2B、突触蛋白-1(Synapsin-1)抗体，购自美国Proteintech公司；β-actin抗体，购自美国Bioworld Technology公司。

1.2 仪器脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；DMS-2型Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所)；VT1200S振荡切片机(德国Leica公司)；三目数字摄影显微镜(日本Nikon公司)；099CK5424匀浆机(美国Glas-Col公司)；1510全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey双色红外激光成像系统(美国基因公司)。

1.3 实验动物与分组♂SD大鼠120只，体质量(250±30)g，购自湖北省实验动物研究中心，合格证号为42000600017418。自由进食饮水2周后，随机分为10组：DMSO组(分为1周组和2周组)、OA组(分为1周组和2周组)、BCP低、中、高剂量组(每个剂量组又分为1周组和2周组)，共10组，每组10只，另选20只备用。

1.4 AD模型的建立、给药及Morris水迷宫训练DMSO、OA组用温水灌胃，BCP治疗组分别用低、中、高剂量BCP水煎液灌胃，所有大鼠灌胃时间均分为1周和2周。1周组在灌胃的d 2开始水迷宫训练，2周组在灌胃的d 9开始水迷宫训练，训练时间均为5 d，水迷宫训练结束后d 2造模(水迷宫训练方法参考文献[10])，选择能在15 s内找到隐藏平台大鼠(其搜索轨迹笔直简单)用于后续实验[12]。造模方式参考本课题组前期实验[13]，分别为DMSO组双侧脑海马各注射10% DMSO 1.5 μL，OA组和BCP治疗组大鼠双侧脑海马各注射OA(0.392 mmol·L-1) 1.5 μL。造模后将大鼠放入温暖环境，等待苏醒。造模24 h后立即进行Morris水迷宫测试。记录实验大鼠寻找隐藏平台的潜伏期和游泳轨迹。实验过程见Fig 1。

1.5 Western blot实验水迷宫测试后，取新鲜大鼠脑海马组织，匀浆后进行Western blot操作。实验方法参照本课题组前期实验[10]。一抗(PME、pS307-PP2Ac、p-Tau-Ser 396、p-Tau-Ser 404、NMDAR 1、Synaptophysin等)孵育过夜；荧光二抗孵育1 h后,TBST洗涤3次，每次10 min。Odyssey扫描仪扫描，ImageJ计算灰度值，SPSS 22.0进行统计分析。

Fig 1 1 week and 2 weeks of experiment procedure

A:1 week of experiment procedure; B: 2 weeks of experiment procedure.

1.6 尼氏染色测试结束后，选3只大鼠进行多聚甲醛灌流，完整的取出整个大脑，浸泡在4%多聚甲醛溶液中，4 ℃冰箱保存。1周后取出大脑，用振荡切片机切片，厚度约30 μm，选取合适脑片进行尼氏染色，中性树胶封片，显微镜下观察拍照分析。

2 结果

2.1 BCP对AD模型大鼠学习记忆能力的影响Fig 2水迷宫实验结果发现，OA模型组大鼠其逃避潜伏期明显延长，同时游泳轨迹凌乱无章，说明大鼠空间学习记忆发生障碍。而低、中、高剂量的BCP不论是1周还是2周治疗组，其逃避潜伏期均明显缩短，目的性强，游泳路程缩短，且呈剂量依赖性。此结果提示，不同剂量的BCP在短期使用和长期使用后，均可明显改善AD大鼠空间学习记忆障碍。

2.2 BCP对AD模型大鼠脑海马组织PP2A活性的调节作用Fig 3的Western blot结果显示，OA组的甲酯酶PME水平增高，进而导致PP2Ac第309位点去甲基化和第307位点磷酸化升高，第309位点的甲基化水平降低。此结果证明，甲酯酶PME增高能引起PP2Ac第309位点甲基化水平降低、第307位点磷酸化升高，最终导致PP2Ac活性下降，说明本实验造模成功。同样的实验结果又发现在BCP中﹑高剂量组中，不管是短时间使用，还是长时间使用，各组甲酯酶PME的表达量及PP2Ac第309位点去甲基化﹑第307位点磷酸化水平均明显下降，而第309位点甲基化水平明显升高，差异具有统计学意义。说明BCP能明显提高PP2Ac活性，且中﹑高剂量组效果更为明显。

Fig 2 1 week and 2 weeks of BCP administration prevented rats from OA-induced spatial memory retention

A: 1 week and 2 weeks BCP administration improved swimming pathways, which were recorded 24 h after OA injection; B: 1 week and 2 weeks BCP administration shortened the escape latency of OA-injected SD rats in a dose-dependent manner.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsbefore OA injection;△△P<0.01vsOA injection.

Fig 3 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration on OA-induced inhibition of n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

2.3 BCP对AD模型大鼠脑海马组织中Tau蛋白磷酸化水平的调控作用Fig 4结果显示，OA模型组Tau蛋白pT181、pT231、pS396、pS404这4个位点的磷酸化水平高于DMSO对照组，说明OA确能上调Tau蛋白的磷酸化水平。而BCP治疗1周和2周的中、高治疗组，其Tau蛋白pT181和pS404位点的磷酸化水平明显下降，且具有明显的剂量依赖性。说明中、高剂量的BCP均能明显降低Tau蛋白的异常磷酸化。

Fig 4 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration onOA-induced Tau hyperphosphorylation in SD rat n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

2.4 BCP对AD模型大鼠脑海马组织突触相关蛋白表达的影响如Fig 5所示，OA组突触蛋白表达较DMSO组明显下降，说明OA能明显降低突触相关蛋白的表达量。BCP治疗组突触蛋白较OA组增加，BCP中﹑高剂量组灌胃1周其海马组织Synapsin-1和NMDA-2B蛋白表达上调，而Synaptophysin蛋白在用药第1周的各组中也表达升高；在BCP灌胃2周的高剂量组，Synapsin-1蛋白增加，同时该中﹑高剂量组的Synaptophysin和NMDA-2B蛋白表达同样增加。说明中﹑高剂量的BCP可明显提高OA诱导的AD模型大鼠脑海马组织中的突触相关蛋白表达量。

2.5 BCP对AD模型大鼠脑海马神经元活性的影响Fig 6尼氏染色结果发现，OA模型组与DMSO对照组相比脑海马CA1和CA3区其尼氏小体着色变浅，数量明显减少。而BCP中、高剂量组在大鼠脑海马CA1和CA3区神经元尼氏小体着色加深且数量增多，特别是2周组，同时还具有剂量依赖性。此结果证明，中、高剂量BCP在两个时间点均能增加大鼠脑海马尼氏小体数量，恢复AD大鼠神经元活性。

3 结论

AD患者因其高昂的护理和治疗成本，给家庭和社会带来沉重的经济压力和精神负担，因此，寻找防治AD的有效药物就显得尤为重要。本课题组前期实验发现，BCP能抑制蛋白激酶GSK-3β活性，改善因该酶活性升高诱导的AD模型大鼠认知功能障碍，促进神经发育[10]。说明该药在防治AD方面具有重要的研究价值。大量文献已证明，PP2A活性降低可促进Tau蛋白过度磷酸化，最终导致NFTs形成[14]。因此，寻找能有效提高PP2A活性的药物就成为AD防治的重要研究内容，同时，查询文献又未发现BCP能作用于PP2A信号通路，逆转AD的病理改变。因此，本研究拟采用大鼠脑海马注射PP2A特异性抑制剂OA来构建AD动物模型，再给予BCP处理，探讨使用不同剂量的BCP是否具有改善OA诱导的AD模型大鼠认知功能障碍的作用，并探明此药的量效关系和不同使用时间(即1周和2周两个时间点)的药效关系。

本实验的水迷宫实验结果发现，大鼠脑海马注射OA能导致大鼠空间学习记忆障碍，而该模型中不同剂量的BCP在使用1周和2周后，均可明显改善OA诱导的AD模型大鼠空间学习记忆障碍，且呈剂量依赖性。提示BCP在行为学方面具有改善学习记忆能力的作用。

Fig 5 Effects of 1 week and 2 weeks of BCP administration on OA-induced synaptic proteins in SD rat n=10)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOA injection

Fig 6 Effects of 1 week(A) and 2 weeks (B) of BCP administration on OA-induced Nissl body decrease in SD rat hippocampus n=3)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsOA injection

为探明BCP增加学习记忆能力的机制，研究者又进行了Western blot实验，以检测PP2A信号通路中各相关蛋白表达情况。结果发现，BCP能有效抑制AD模型大鼠脑海马组织中PME的表达，该酶作用的底物蛋白PP2A总的表达量虽未见明显变化，但PP2A的催化亚基——PP2Ac的甲基化、去甲基化和磷酸化水平均有明显改变，其中PP2Ac甲基化水平升高，而去甲基化和磷酸化水平明显降低，最终提高了PP2A活性。故研究者认为，两个时间点的BCP均能通过抑制PME表达，来上调AD模型大鼠脑海马中的PP2A活性。

BCP是否能够通过上调PP2A活性来下调Tau的磷酸化水平呢？本研究又选取了与PP2A相关的Tau蛋白磷酸化特异性位点修饰情况进行研究。结果发现，预先给予两个时间点的BCP，即使脑海马注射了PP2A特异性抑制剂，Tau蛋白pT181、pT231、pS396、pS404这4个位点的磷酸化水平也明显下降(该4个位点的过度磷酸化均能不同程度促进NFTs的形成[15])，且与剂量密切相关。上述实验结果提示，BCP能通过上调PP2A活性，来下调Tau蛋白特异性位点的磷酸化水平。

由于认知水平与海马组织中突触相关蛋白表达水平存在正相关，因此，我们又检测了使用BCP后AD大鼠脑海马中突触相关蛋白的表达情况。结果发现，BCP灌胃1周和2周后，突触相关蛋白Synapsin-1、NMDA-2B及Synaptophysin表达均明显增高，其中、高剂量组尤为明显。提示BCP可提高因PP2A活性下降导致的AD模型大鼠脑海马组织中突触相关蛋白的表达水平，促进突触发育。

尼氏小体结构变化能反映神经元功能情况，当受损神经元功能修复后，已溶解甚至消失的尼氏小体可重新出现[16]。为验证BCP是否具有修复受损神经元的功能，我们又进行了尼氏小体染色实验。结果发现，中、高剂量的BCP使用1周和2周后，均能使AD模型大鼠脑海马CA1和CA3区尼氏小体数量增多，着色加深，并呈剂量依赖性。提示中、高剂量的BCP能在不同时间点增加尼氏小体的数量和分布，修复AD大鼠脑海马受损神经元。

综上所述，BCP能有效改善OA诱导的AD模型大鼠认知功能障碍，其可能的作用机制是通过调节PP2A信号通路中各相关蛋白的表达水平，进而上调PP2A活性，最终降低了Tau蛋白的磷酸化水平。同时，还可通过上调PP2A活性，提高海马组织中突触相关蛋白表达水平，修复受损神经元，且该药效与其使用时间、剂量具有一定相关性。这一研究结果可为BCP的临床应用提供实验依据，但要明确其有效作用成分还有赖于进一步的研究探讨。