真武汤治疗慢性心力衰竭的网络药理学机制研究

伍燕宏， 郑景辉， 朱梓铭， 罗蔚

（1.广西中医药大学研究生院，广西南宁 530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁 530011）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于心脏结构或功能异常致使心室充盈受阻或射血分数降低的复杂临床综合征[1]，也是心血管疾病发展进程的最终阶段。近年来，心力衰竭患者在全球高达两千万人，且仍在继续以二百万的速度在递增。据《中国心血管病报告2017（摘要）》最新发布统计，我国心力衰竭患者已有450万[2]。大量数据资料显示，CHF已严重危及人类健康。西医学认为CHF治疗以改善心室重塑为主，但总体效果不佳[3]，而中医药治疗CHF具有明显的优势及鲜明的特色。

中医学认为CHF病机主要包括心气不足和水湿痰瘀两方面，治疗应温阳益气、化痰逐瘀[4，5]。真武汤源于《伤寒论》，是阳虚水泛证CHF治疗的常用方剂。但是真武汤治疗CHF的机制尚未明确，本研究运用网络药理学对真武汤治疗CHF的机制进行了探讨，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1资料来源登录在线中医药生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），输入关键词“真武汤”，进行系统查询。再从上述查询的真武汤内容中寻找治疗CHF的数据，显示有11种预测靶蛋白，具体见图1。

1.2方法分别利用Metascape对上述11种预测靶蛋白富集总分析，通过David 6.7在线进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，同时基于BATMAN-TCM自身的网络绘制工具得出疾病——靶点——成分相关数据[6]。

2 结果

2.1预测靶蛋白选取查询到真武汤治疗CHF的预测蛋白共有11种，分别是血管紧张素转换酶（ACE）、α2A肾上腺素能受体（ADRA2A）、α2B肾上腺素能受体（ADRA2B）、肾上腺素能β受体激酶1（ADRBK1）、血管紧张素II 1型受体（AGTR1）、钠钾ATP酶α1亚基（ATP1A1）、钠钾ATP酶α2亚基（ATP1A2）、α1G T型钙离子通道蛋白（CACNA1G）、α1LT型钙离子通道蛋白（CACNA1L）、可溶性鸟苷酸环化酶（GUCY1B3）、肿瘤坏死因子（TNF）。调整后的P值为2.70E-03。

图1 BATMAN-TCM系统查询结果Figure 1 The search results from BATMAN-TCM

2.2 Metascape分析对11种预测靶蛋白进行Metascape热图富集总分析及预测靶蛋白途径和通路富集分析。对于每个给定的基因列表，本研究都使用以下的本体来源进行路径和过程富集分析：KEGG通路、GO生物学进程、靶基因表达集合、典型通路和蛋白复合体数据库（CORUM）。基因组中的所有基因都被用作富集背景。此次收集P＜0.01的项，最小计数为3，富集因子＞1.5（富集因子是观察到的计数与随机期望的计数之比），并根据它们的隶属度相似性将其分组到集群中。因此，本研究结果发现，这些预测靶蛋白与血液循环、环磷酸鸟苷酸（cGMP）——蛋白激酶G（PKG）信号通路、肌肉收缩、心脏收缩、细胞分泌的调节、肾素分泌、脂质代谢负调控、氮化合物细胞应答有关。其中血液循环、cGMP-PKG信号通路、平滑肌收缩3项占比高。详见图2和表1。

2.3 GO富集分析及KEGG通路分析通过David 6.7在线对GO富集分析的结果显示：这些蛋白主要的生物学过程（biological process，BP）分析共47条，P≤0.01有28条，涉及血管收缩的调节、平滑肌收缩的调节、血压调控、糖苷化反应、G蛋白偶联受体信号通路激活表皮生长因子受体、肾上腺素分泌的负调节、通过肾上腺素能受体信号通路激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性、肾素——血管紧张素调节全身动脉血压、心脏收缩的负调节、钾离子通过质膜内流、膜复极化等方面，见图3。细胞组件（cellular component，CC）分析显示 14条，P≤0.05有11条，其预测蛋白主要在质膜、核内体、钠钾交换ATP酶复合体、电压门控钙通道复合体、横小管、膜的完整成分、闰盘、细胞外囊泡、质膜的完整成分、细胞内膜结合细胞器、小窝等，见图4。分子功能（molecular function，MF）分析12条，P≤0.05有11条，预测蛋白涉及缓激肽受体结合、低电压门控钙通道活性、α2肾上腺素能受体活性、甾类激素绑定、肾上腺素结合、钠钾交换ATP酶活性、钠离子绑定、钾离子结合、核苷酸绑定、药物绑定、分子伴侣等功能，见图5。从数据中我们发现，GO分析生物学过程排位靠前的主要是血管调节、平滑肌调节、血压调节。生细胞组件分析结果提示，质膜、膜及其组成部分比例较大。分子功能分析结果提示，核苷酸绑定占比明显。KEGG通路分析共显示14条，P≤0.05有12条，其中9条信号通路与本研究疾病相关。炎症相关通路（1条）：MAPK信号通路；与神经——体液代谢有关（6条）：心肌细胞肾上腺素能信号传导、肾素分泌、醛固酮的合成与分泌、肾素——血管紧张素系统、近端小管重碳酸盐吸收、醛固酮调节钠重吸收；与心脏功能和血管舒张有关（2条）：cGMP-PKG信号通路、钙信号通路。见图6。

图2 Metascape热图富集总分析Figure 2 Metascape enrichment total analysis

表1 预测靶蛋白途径和通路富集分析Table 1 The predicted target protein pathways and pathway enrichment analysis

图3 BP分析Figure 3 BP analysis

图4 CC分析Figure 4 CC analysis

图5 MF分析Figure 5 MF analysis

图6 KEGG通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis

2.4 “靶点——通路——疾病”网络对BATMANTCM自身预测到的候选目标（包括已知目标）Score cutoff≥124的每种成分，进一步进行生物信息学分析。显著富集KEGG通路/GO分析/TTD疾病/OMIM疾病，调整后P＜0.05，获得“靶点——通路——疾病”网络。为清晰呈现，本文仅提供部分“靶点——通路——疾病”网络图，见图7，图中显示：与心力衰竭疾病相关的预测靶蛋白ADRA2B与神经——体液代谢、cGMP-PKG信号通路有关。

3 讨论

网络药理学是依托组学和大数据高速发展基础，结合系统生物学、网络生物学、药理学等多门学科的交叉互接，运用网络组学分析对基因、靶点、药物、疾病间复杂关系进行新药开发及新兴方法设计[7，8]。可以说，网络药理学打破常规“一药、一靶，一病”的局限研究模式，对复方药物“多成分、多路径、多靶点”的开展提供广阔前景，尤其是中药配伍规律的探索。中药复方运用网络药理学研究可更明确中药治疗疾病的机制，为临床选择中药治疗疾病铺设了一个较好的基础。

图7 部分“靶点——通路——疾病”网络图Figure 7 Part“Target-pathway-disease”network

CHF属于心血管器质性疾病中最严重的并发症。虽然目前治疗遵循“强心”、“利尿”、“扩冠”为基础原则，旨在阻止心肌重构过程的发展，但仍不能扭转终末期心力衰竭快速进展演变的过程。同时，西药对患者个体存在差异，出现许多不良反应，致使西医治疗CHF最终束手无策。真武汤具有强心利水、扩血管、改善血液循环及护肾之功，其在现代药理学研究中已被证实[9]。方中：附子温肾利水，兼暖脾；茯苓、白术健脾化湿、利水；白芍一者利小便、行水气，二者柔肝同时可止腹痛，三者敛阴舒筋；配之生姜温散兼助附子散寒气。诸药配伍共奏温阳利水治疗心力衰竭有效[10]。但其治疗CHF的机制尚未明确，因此，本研究运用网络药理学理论探讨真武汤治疗CHF的机制。

本次研究运用网络药理学发现，通过BATMAN-TCM系统检索真武汤后，共有11种预测靶蛋白，将11种预测靶蛋白进行David 6.7在线GO功能富集分析和KEGG信号通路分析得出，预测靶蛋白与血管、平滑肌调节，细胞器、核苷酸结合关系较密切。KEGG通路分析结果发现，这些预测蛋白基本与神经——体液调节、信号通路有关联，且肾素——血管紧张素——醛固酮系统（RAAS）是主要的调节机制，MAPK信号通路产生炎症反应影响疾病病理过程，cGMP-PKG信号通路、钙信号通路共同调节血管收缩及舒张。

RAAS系统主要由神经——内分泌系统调节，也是影响CHF预后的重要因素[11]。预测靶蛋白ACE在RAAS中起重要作用，它是ACEI的作用靶点，可将AngI催化水解成AngⅡ，调节电解质、血压和体液稳态。机体AngⅡ被ACE激活后，儿茶酚胺和ALD不断释放、分泌，加速胶原沉积及心肌细胞增殖，致使左心室肥厚、心室重构改变，诱导心肌细胞快速凋亡，最终促进CHF形成。陈亮等[12]研究ACE基因多态性与老年CHF心室重构发现，ACE DD型水平较Ⅱ型水平高，且DD型组的左室射血分数明显低于ID型及II型基因组，证明ACE DD型患者血清及心肌内ACE活性相对较高。现学者一致认为造成此现象与ACE DD基因型有关。孙勇[13]研究ACE多态性与CHF患者运动实验的结果表明，DD/ID型基因患者运动耐力低的同时还有较高的对抗运动训练。张博等[14]研究也发现DD型患者CHF左心室较ID、Ⅱ基因型患者明显增大，且心功能亦较差，经ACEI治疗后DD型基因组患者出现良性心室重构的逆转，而ID及Ⅱ型基因组患者左心室改善幅度较小，提示ACE DD型基因与CHF发病率有关。ADRA2A、ADRA2B两个同源亚型属于α2肾上腺受体（α2-AR），作用机制是α2-AR选择性与儿茶酚胺类物质识别结合后，启动细胞内信号转导通路，诱发CHF病理、生理的多种反应[15，16]。预测蛋白AGTR1也是RAAS中一个关键影响因素。在CHF过程中，因肾血流量灌注减少，AngⅡ与AGTR1受体结合后，激活磷脂酶C，二磷脂酞肌醇随之发生水解，促进细胞内Ca2+快速释放，从而导致血管收缩，进一步使细胞凋亡，最终诱发心室重构的演变。目前研究学者认为AGTR1影响CHF可能与A1166C等位基因有关。因此，AGTR1靶蛋白在CHF中的作用仍需进一步探究，以期为今后的研究者提供新的突破口。

炎症反应是心血管事件发生的一个重要机制，其活化程度与CHF过程有关。MAPK信号通路是细胞外信号调节激酶（ERK）、JNK、p38等3条主要通路的集合点，其形成的转录因子活化蛋白1（AP-1）可间接调控TNF-α、IL-6等多种炎性因子表达。李晓等[17]研究发现，通过ERK/MAPK通路促进心肌细胞凋亡，通过JNK/MAPK通路主要抑制AngⅡ、内皮素、儿茶酚胺激活，通过p38/MAPK通路促进白细胞聚集、活化等共同作用可控制炎性因子的表达，阻滞CHF发生。同期，赵欣等[18]在研究TLR4受体/MAPK信号通路在心源性恶病质发生机制中的作用时发现，JNK/MAPK通路中JNK被SP600125特异性抑制剂阻断后，抑制组的TNF-α mRNA表达量降低，说明TNF-α与JNK/MAPK通路介导有关。TNF-α是评价炎症最常用的细胞因子，在机体创伤机制中最早被激活，可产生炎性介质，促进IL-6因子释放，扩大炎性损伤范围，加速细胞坏死[19]。TNF-α被证实是CHF恶病质的主要炎症因子之一[20]。吴勇进等[21]进行67名CHF和30名健康人的对比研究发现，不同心功能等级的CHF患者左心室射血分数不同程度下降，左心室舒张末期及收缩末期内径亦不同程度升高，其机制与血清中脑钠肽（BNP）、TNF-α、MMP-9、IL-6的表达量有关。心功能越差炎症因子水平越高，这为临床诊断CHF的严重程度提供了很高的参考价值。纪焕春等[22]对60例CHF男性患者的临床研究证实TNF-α水平与CHF程度呈正相关。胡黎文等[23]观察真武汤联合桂枝茯苓丸对CHF患者炎症因子表达情况的影响，发现真武汤联合桂枝茯苓丸可降低CHF患者血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）、IL-6及TNF-α水平，且均较西医常规组明显下降，这可能因其可拮抗神经——内分泌系统过度激活，从而逆转心室重构，改善了CHF程度。可以认为TNF-α在CHF发生、发展过程中发挥着重要介导作用[24，25]。

cGMP是细胞内第二信使物质，可调控心血管功能、基因表达及形态学，其中以调控离子通道为主。而当它刺激其下游靶点PKG后可对抗心肌细胞凋亡。PKG主要调控血管平滑肌松弛过程中多种类型细胞表达，其中血小板和内皮细胞最为重要。前期证明，PKG磷酸化血管扩张刺激磷蛋白（p-VASP）后，可使血管平滑肌舒张[26]。对于其机制，现有学者认为，PKG是通过抑制心肌重塑的病理性Ca2+信号及其下游钙调磷酸酶——活化T细胞核因子（NFAT）、钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）通路的激活作用，从而参与心脏的重构。这与万淼等[27]对蛋白激酶G对左室重构的影响展开的讨论结果相似。可见，cGMP-PKG信号通路主要是通过调控Ca2+浓度来调节心脏的收缩舒张功能，从而影响心室重构，最终发展成CHF。另外，钙信号通路异常可影响心肌细胞在舒张期出现Ca2+从肌浆网内大量漏出现象，一旦Ca2+失稳出现，心肌收缩减弱，CHF将会加重[28]。储存在CHF患者心肌细胞中的肌质网钙泵（SERCA2α）磷酸化被下调后可造成Ca2+回收受阻减少[29]，进而导致细胞迁移、心室重构发生。因此，SERCA2a是目前CHF治疗中被视为最有潜力的蛋白。若兰尼碱受体2（RyR2）Ca2+释放通道失调，易促心肌细胞去极化，诱发CHF和心律失常[30]。故需保护RyR2泵的完整，避免Ca2+渗漏，以阻碍CHF发生。本研究中，本课题组还发现了 ADRBK1、ATP1A1、ATP1A2、CACNA1G、CACNA1L、GUCY1B3蛋白，它们在CHF发生及发展过程中应参与的调控作用尚未被清楚诠释。

本次研究未能对基于数据库挖掘发现的真武汤治疗CHF的主要靶蛋白进行实验认证，此为本研究存在的不足。本研究通过运用网络药理学挖掘真武汤治疗CHF的蛋白，探讨真武汤治疗CHF的内在机制，增强了对其微观整体的认识，揭示了疾病更深的内在调控机制，为CHF的发生、发展研究奠定了基础，从未被诠释的蛋白诠释其作用机制无疑对后期的实验研究打开了新空间，开辟了新的方向。