清热化痰通腑方灌肠对脑梗死合并细菌性肺炎模型大鼠脑、肺、肠组织神经肽的影响

赵亮娟， 郑雪嘉， 吕军影， 李凯， 刘霞

（广西医科大学第一附属医院中医科，广西南宁 530021）

脑卒中是人类健康的一大杀手，其死亡率和致残率居高不下[1]。卒中相关性肺炎（strokeassociated pneumonia，SAP）是其常见的一种严重并发症[2]，为脑卒中急性期或后遗症期并发的肺间质及肺实质（包括肺泡壁）感染性炎症[3]。炎症反应是脑卒中最重要的病理机制。研究[4，5]发现，血管活性肠肽（vasoactine intestinal peptide，VIP）和P物质（substance P，SP）是2种作用机制相反的神经递质性物质。在机体正常情况下，VIP能够扩张脑、肺血管，松弛支气管平滑肌，参与炎症细胞功能的调节，抑制促炎细胞产生炎症因子。SP与脑水肿的形成密切相关，可产生多种炎症因子如白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α），促进局部和全身的炎症反应。

中医药疗法对卒中患者伴有的多种并发症可发挥辨证论治优势，减轻病原体对机体的损害，能更好地改善临床症状，提高临床疗效。清热化痰通腑方是我科全国名老中医药专家黄李平教授通过总结其多年临床经验和学术思想而形成的经验方，从“脑肠相通”、“脑肺相通”、“肺肠相通”三者论治SAP[6]。本课题组前期临床研究[7]表明，应用清热化痰通腑方直肠滴注治疗脑病并发肺部感染患者，可有效减轻炎症反应，增强抗菌效应，但其作用机制仍有待进一步阐明。

因此，本研究旨在通过观察清热化痰通腑方灌肠对脑梗死合并细菌性肺炎大鼠神经功能和脑、肺、肠组织神经肽VIP、SP的影响，从神经肽分泌角度探讨该方治疗脑梗死合并细菌性肺炎的可能效应机制，以期为临床应用提供依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物健康SPF级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体质量（220± 20）g，购于广西医科大学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK桂2014-0002。所有大鼠均统一饲养于广西医科大学实验动物中心SPF级实验动物室，自由饮水和进食，购入后经5 d饲养，待大鼠熟悉实验环境后进行造模，造模前12 h禁食不禁水。

1.2药品与试剂清热化痰通腑方组成：大黄30 g（后下）、牛膝30 g、瓜蒌仁30 g、枳实20 g、黄芩20 g、石菖蒲20 g、胆南星20 g、芒硝15 g（冲）。药物总量185 g。以上中药材饮片均购自广西医科大学第一附属医院中药房。苏木素——伊红（HE）染色剂，4%多聚甲醛固定液（均购自北京索莱宝科技有限公司，批号依次为：G1120、P1116）；铜绿假单胞菌标准菌株（10104）由广西医科大学微生物教研室提供（购自中国药品生物制品检定所）；PBS缓冲液（购自北京博奥森生物技术有限公司，批号：C01-01001）；大鼠VIP酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（批号：CSB-E08355r）、SP ELISA试剂盒（批号：CSB-E08358r）（均购自武汉华美生物工程有限公司）。

1.3仪器酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；组织切片机（德国Leica公司）；显微镜（德国Carl Zeiss公司）；37℃恒温箱（英国New Brunswick公司）；医用-80℃低温箱（三洋电机株式会社公司）；直径0.28 mm鱼线（北京生化科技有限公司）；无菌注射器（北仑河上海医疗技术有限公司）；抗凝管（江西精致科技有限公司）；持针器、眼科剪等手术器械（上海医疗器械有限公司）。

1.4动物分组及给药将30只SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表分为空白对照组，模型组，中药低、中、高剂量组，每组6只。参照标准动物的体表面积等效剂量折算系数法计算给药剂量[8]，成人（60 kg）与大鼠（200 g）的换算系数为6.17，清热化痰通腑方成人生药剂量是185 g/d，换算成大鼠的用药剂量为3.826 g/d≈3.8 g/d，设置大鼠用药低、中、高剂量分别为1.9、3.8、7.6 g/d。灌肠给药时，将浓缩药液按上述低、中、高剂量用无菌生理盐水配制成等容积药液8.0 mL后给药。模型建立24 h后，中药低、中、高剂量组分别给予1.9、3.8、7.6 g/d清热化痰通腑方药液灌肠，模型组给予等量生理盐水灌肠，1次/d，连续7 d，空白对照组不予处理。

灌肠给药方法：参照文献[9]，用大鼠固定器将大鼠固定，保持头低位，常规消毒大鼠肛周，用直径2 mm、长约15 cm的小儿硅胶灌肠管，一端连接注射器，另一端涂上石蜡油润滑，由大鼠肛门轻缓插入肠道约6 cm处，缓慢匀速注入药液，注完药液后再向管内推入约0.4 mL空气，然后将大鼠保持头低位约3 min，同时轻按肛门使之利于药液灌入同时避免药液外溢。

1.5脑梗死合并细菌性肺炎大鼠模型的复制参照本课题组前期文献[10]复制脑梗死合并细菌性肺炎大鼠模型。建模24 h后，符合以下条件的大鼠判断为建模成功：①出现精神萎靡、进食量减少、饮水增多，毛发耸立、光泽度差、背部微弓、体质量降低、耳缘静脉突起加粗、鼻唇分泌液增多；②呼吸急促，肺部听诊可闻及啰音。

1.6大鼠神经功能缺损评分大鼠灌肠给药7 d后，采用Longa评分法[11]进行神经功能缺损评分：0分，无神经功能缺损症状；1分，有轻度神经功能缺损表现，不能完全伸展左侧前爪；2分，有中度局灶性神经功能缺损表现，向左侧转圈；3分，有重度局灶性神经功能缺损表现，向左侧倾倒；4分，不能自发行走，意识水平下降。评分1～3分计为造模有效，剔除0分及4分大鼠，剔除后在后续实验中随机补充入组，保证每组大鼠的数目不变。

1.7标本采集与处理灌肠给药7 d后禁食12 h，水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，非抗凝采血管内静置2 h，于4℃、2 000 r/min离心15 min，收集上清液，分装，-80℃保存，用于ELISA法检测。取肺、直肠组织，一部分置于4%多聚甲醛固定液固定，制备石蜡切片，用于HE染色，一部分装冻存管保存于-80℃，用于ELISA检测。取脑组织，加入1 mL 1×PBS溶液，制成组织匀浆，-20℃过夜，反复冻融2次后，4℃、2 000 r/min离心15 min取上清液，分装-80℃保存，用于ELISA检测（肺、直肠组织同此处理方法）。以上检测均严格按照相应试剂盒说明书进行。

1.8观察指标

1.8.1 一般状况 造模后隔日测量大鼠体质量、体温，观察大鼠的被毛、活动状态、鼻周分泌物、排便量等一般情况的变化。

1.8.2 HE染色 将制备的肺、直肠组织石蜡切片，依次进行脱蜡，先后加入苏木素、伊红染液染色，最后脱水、封片，置于光学显微镜下行病理学观察。

1.8.3 ELISA法检测血清及脑、肺、肠组织VIP、SP含量 使用Curve Expert 1.3曲线软件，以标准品的浓度为纵坐标，以标准品的吸光度（OD）值为横坐标，制作标准曲线。分别测定血清及各组织VIP、SP的OD值，根据标准曲线计算出VIP、SP含量。

1.9统计方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用方差分析，组间比较用SNK法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般状况空白对照组大鼠状态良好，饮食量稳定，被毛光滑，呼吸平稳均匀，排便正常，未见明显异常表现；模型组大鼠造模后出现行动迟缓、饮食量减少、被毛杂乱干枯、弓背、大便量少、质地干硬等现象，还可见鼻周大量分泌物并伴随打喷嚏、呼吸喘促加重等症状；中药低剂量组大鼠行动迟缓，饮食减少，鼻周见较多分泌物并伴随打喷嚏，大便量较模型组有所增加但仍有些许干硬；中药中剂量组大鼠倦怠，饮食稍有增加，鼻周少量分泌物，大便量较低剂量组增加，且软硬适中；中药高剂量组大鼠状态明显改善，鼻周分泌物不明显，大便量较多。

2.2各组大鼠造模后不同时间体质量、体温比较表1、表2结果显示：空白对照组大鼠体质量持续稳定增长，体温基本不变。造模7 d后，模型组大鼠体质量较空白对照组显著减少（P＜0.01）、体温显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组大鼠体质量均增加、体温均降低（P＜0.05或P＜0.01），其中，中药高剂量组大鼠体质量、体温与空白对照组比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

表1 各组大鼠造模后不同时间体质量比较Table 1 Comparison of the body mass of rats in various groups at different time after modeling（-x±s，m/g）

表2 各组大鼠造模后不同时间体温比较Table 2 Comparison of the body temperature of rats in various groups at different time after modeling （-x±s，T/℃）

2.3各组大鼠神经功能缺损评分比较表3结果显示：空白对照组大鼠无神经功能缺损。模型组大鼠神经功能缺损评分明显高于空白对照组大鼠（P＜0.01）。中药低、中、高剂量组神经功能缺损评分均低于模型组，呈剂量依赖性，其中，中药高剂量组大鼠神经功能缺损评分降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4各组大鼠肺、肠组织病理学改变

2.4.1 肺组织病理学改变 图1结果显示：空白对照组大鼠肺组织结构完整，未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠肺泡水肿、充血明显，肺泡间质增宽，伴有大量炎性细胞浸润。中药低、中剂量组大鼠可见肺泡水肿、充血，肺泡间质均增宽，但所浸润炎性细胞较模型组有所减少；中药高剂量组大鼠肺泡水肿、充血现象明显缓解，肺泡间质未见增宽，伴少量散在炎性细胞浸润。

表3 各组大鼠神经功能缺损评分比较Table 3 Comparison of the neurological deficit scores of rats in various groups (-x±s)

2.4.2 肠组织病理学改变 图2结果显示：空白对照组大鼠肠组织结构完整，黏膜无明显缺损，未见充血、水肿、糜烂等病理改变，黏膜固有层无明显炎性细胞浸润。模型组大鼠肠组织有明显坏死灶，肠壁少数坏死黏膜组织脱落后形成溃疡点，大量炎性细胞浸润黏膜下层。中药低剂量组和中剂量组大鼠肠组织坏死灶较模型组有所减少，肠壁坏死与溃疡点有所缓解，但仍有大量炎性细胞浸润；高剂量组大鼠肠组织坏死及溃疡较模型组明显减轻，固有层腺体排列整齐、破坏减少，黏膜层及黏膜下层炎性细胞浸润较少。

2.5 各组大鼠血清及脑、肺、肠组织中VIP、SP含量情况

2.5.1 各组大鼠血清及脑、肺、肠组织中VIP含量比较 表4结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠血清及脑、肺、肠组织中VIP含量均降低（P＜0.01）；与模型组比较，各中药剂量组VIP含量均升高，且呈剂量依赖性。

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological features of lung tissues of rats in various groups（HE staining，×200）

图2 各组大鼠肠组织病理变化（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of the pathological features of intestine tissues of rats in various groups（HE staining，×200）

表4 各组大鼠血清及脑、肺、肠组织VIP含量比较Table 4 Comparison of the VIP content in serum，and brain，lung，intestine tissues of rats in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

表5 各组大鼠血清及脑、肺、肠组织SP含量比较Table 5 Comparison of the SP content in serum，and brain，lung，intestine tissues of rats in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.5.2 各组大鼠血清及脑、肺、肠组织中SP含量比较 表5结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠血清及脑、肺组织SP含量明显升高（P＜0.01），肠组织SP含量则显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组血清及脑、肺组织SP含量均降低（P＜0.05或P＜0.01），肠组织SP含量显著升高（P＜0.01），且呈剂量依赖性，其中，中药中、高剂量组肠组织SP含量高于空白对照组（P＜0.05或P＜0.01）。

3 讨论

脑卒中是严重危害人类健康的全球性公害，其起病急骤，变化迅速，转归预后常发生在瞬间，目前已成为我国第一大致残及第二大死亡原因，而肺炎是导致患者死亡的主要原因。本研究发现清热化痰通腑方能够改善脑梗死合并细菌性肺炎大鼠的一般状态、体质量、体温，促进大鼠排便，减轻肺、肠组织病理学损伤，促进脑神经功能恢复，从而达到脑、肺、肠三者同治的作用。

神经肽（neuropeptide）是体内传递信息的生物活性多肽，不仅对神经元起作用，而且对非神经组织或器官也有作用，VIP和SP均归属其中。李焕峰等[12]认为VIP因子是存在于中枢神经系统和肠道系统的一种神经递质，可通过促进缺血区域周围血管的再生达到减轻脑缺血损伤的作用；而在消化系统中，VIP既能调节肠道动力又可调节肠液分泌，与便秘关系密切。研究[13]表明，在脑梗死大鼠的侧脑室注射VIP后，MCAO大鼠脑梗死体积减小，血管新生数增加，血管内皮生长因子蛋白表达增加，说明VIP能促进神经生长，增加血管内皮生长因子，对脑缺血后的神经再生和神经功能恢复有较好的作用。Wald A[14]通过实验证实经给人体静脉注射VIP后，可导致肠液分泌增加，出现严重的腹泻，说明VIP能够刺激肠道分泌电解质和水液增加。SP则与中枢神经系统的炎症反应有重要关系，并在便秘和肠炎中发挥重要作用[15，16]。大鼠缺血性脑卒中后使用SP受体拮抗剂可以抑制SP的分泌，减少大鼠脑水肿，改善血脑屏障通透性和神经功能[17]。本实验结果显示，模型组大鼠血清及脑、肺、肠组织VIP含量均较空白对照组明显下降，血清，脑、肺组织SP水平显著升高，而肠组织中SP水平明显降低，并且出现神经功能缺损、行动迟缓、便秘等症状。出现此结果的原因可能是模型大鼠脑神经元分泌VIP能力下降，加重继发性脑损害，同时，血管周边神经元损伤使SP增加，引起炎症介质IL-6的释放，导致脑组织水肿形成，进一步加重神经功能损害和脑组织炎症扩大。

那么，卒中后合并肺部细菌侵袭，肺组织VIP下降、SP水平升高，可使肺血管扩张，血管通透性增加，引起炎性渗出，继而激活肥大细胞、巨噬细胞等释放IL-6等炎性细胞因子，发生组织水肿，加重炎症损害。而在肺部细菌性感染后，肺源性内毒素通过血液循环、微生态、淋巴循环、神经——内分泌等影响相应神经肽水平的变化，又加重了脑和肠组织的免疫炎症损害。脑组织损伤引起脑——肠轴紊乱，肠道VIP和SP水平降低，导致肠道蠕动功能减弱、肠液分泌减少，大鼠出现便秘。肠道功能紊乱引起肠源性内毒素增多，其通过循环系统和脑——肠轴反馈调节脑、肺等组织出现相应脑肠肽的变化，进而再次加重局部组织炎症和损害。以上分析提示，脑梗死合并细菌性肺炎大鼠脑、肺、肠三者同病，神经内分泌重要物质基础VIP、SP失调可激活大鼠局部及全身的炎症反应，而炎症和炎症介导的组织损伤又进一步加剧了原发疾病的功能损害。

卒中相关性肺炎属中医学“肺热”、“喘证”等范畴。中风后患者出现咳嗽、咳痰、发热等症状，医家多以痰热郁肺或邪热壅肺论治[18]。本研究中的清热化痰通腑方是黄李平教授通过病证结合总结出来的“脑肺同治、脑肠同治、肺肠相通”学术思想的结晶。因肺与大肠相表里，黄李平教授认为脑卒中合并肺部感染的患者需通利大肠，使肠腑气机通畅，达到通腑治肺、通腑治脑，脑、肺、肠三者同治的效果。方中以通腑之要药大黄为君药，泻下攻积、清热解毒、活血逐瘀，臣药芒硝泻下软坚、清热除湿，枳实破气消积、化痰除痞，三者相辅相成，可达泻热通腑之效。佐以黄芩清热燥湿、凉血解毒，瓜蒌仁清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠，胆南星清热化痰，石菖蒲芳香化湿、开窍豁痰。牛膝活血通经、引火（血）下行为使药。现代研究表明，大黄、芒硝、枳实均有调节胃肠功能、抗炎、抗病原微生物等药理作用，大黄与芒硝配伍能够抑制IL-6、IL-1、TNF-α等促炎因子的释放，提高抑炎因子IL-10含量，从而调节促炎和抗炎因子的平衡，保护胃肠道黏膜[19，20]。黄芩具有抗菌作用[21]。胆南星有祛痰和抗惊厥、镇静的药理作用[22]。而瓜蒌中的有效成分对多种细菌有很强抑制作用[23]，可促进骨髓中T淋巴细胞前体转化为成熟的T淋巴细胞，提高细胞免疫，减轻炎症，减少分泌物，有很好的祛痰作用[24]。石菖蒲挥发油具有化痰平喘的作用[25]。本研究应用清热化痰通腑方对模型大鼠进行干预后，结果发现：中药各剂量组大鼠一般状况均明显改善，神经功能缺损评分下降，高剂量治疗组大鼠恢复最好，接近空白对照组水平。HE染色结果显示，中药各剂量组肺、肠组织病理性改变和炎性细胞浸润情况均较模型组明显改善，尤以高剂量组最佳。说明清热化痰通腑灌肠可有效治疗脑梗死合并细菌性肺炎大鼠。

另外，ELISA结果显示，中药各剂量组大鼠血清，脑、肺组织中VIP升高，SP含量降低，肠组织VIP、SP升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。说明清热化痰通腑方肠道给药通过上调肠组织VIP、SP水平，促进肠蠕动和肠液分泌，达到通腑的作用；清热化痰通腑方可能经脑——肠轴上调脑组织VIP水平、下调SP含量，促进脑血管再生，减轻脑水肿，恢复脑神经功能，起到通腑治脑的作用，同时，清热化痰通腑方可能通过上调血清和肺组织中VIP含量、下调SP水平，从而抑制巨噬细胞和肥大细胞分泌促炎因子IL-6等减轻肺部炎症，起到通腑治肺的作用。

综上所述，清热化痰通腑方灌肠给药治疗脑梗死合并细菌性肺炎大鼠，能够减轻脑、肺、肠各组织及全身炎症反应，减轻脑水肿，促进神经功能恢复，尤以高剂量组效佳，其机制可能是通过调节体内神经肽VIP、SP的含量而发挥作用。