溃结宁膏穴位敷贴对溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

郑洁， 朱莹， 高昂

（1.浙江省瑞安红十字医院，浙江温州 325200；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；3.湖南省长沙市望城区人民医院，湖南长沙 410200）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病。该病多呈反复发作的慢性病程，治疗难度大，复发率高，具有一定的癌变率。流行病学研究表明，UC发病率在我国呈现明显增长趋势[1]。控制UC的发生发展具有重要的意义。临床UC患者常见不同程度的脾肾阳虚表现，亦有学者通过系统检索对UC中医证候进行整理，提示脾肾阳虚型发生率居各证型之首[2]。溃结宁膏是由本课题组负责人朱莹教授通过总结治疗UC（脾肾阳虚证）的经验而创制的。该穴位敷贴疗法基于中医辨证和经穴——脏腑相关理论指导，结合药物吸收与穴位刺激共同发挥温肾暖脾、活血化瘀之效，疗效确切，中医特色鲜明，已成为国内外重点开发的外治给药途径[3，4]。本研究观察溃结宁膏穴位敷贴对UC（脾肾阳虚证）模型大鼠ToU样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子kappaB（NF-κB）信号通路的影响，探讨其作用机制，以期为临床治疗UC提供更多的科学依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号为SCXK（湘）2011-0003，SPF级实验室许可证号为SYCK（湘）2013-0005。实验室温度恒定20～26℃，湿度控制40%～70%，饲养环境为多层层流架，标准饲料喂养，三级过滤纯净水自由饮用。大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2药品溃结宁膏穴位敷贴的药物组成：炮附子、细辛、延胡索、赤芍、丁香、白芥子、生姜；无药物的巴布剂基质敷贴的药物组成：聚丙烯酸钠、明胶、高岭土、甘羟铝、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇。均由湖南中医药大学第二附属医院药剂科制成直径0.4 cm、厚0.25 cm的药饼。柳氮磺胺吡啶片（SASP），购自上海三维制药有限公司。

1.3试剂与仪器2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，美国Sigma公司）；腺嘌呤（美国Sigma公司）；TLR4、MyD88、NF-κB的PCR引物（英骏生物技术有限公司）；反转录试剂盒（德国罗氏试剂）；TLR4、NF-κB、MyD88抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；免疫组化试剂盒DAB显色剂（上海拜力生物科技有限公司）。Neofuge 15R台式高速冷冻离心机（力康生物科技有限公司）；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）；Step One Plus荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；RM2016病理切片机（武汉俊杰电子有限公司）；CIC XSP-C204显微镜（重庆光电仪器有限公司）；TYXH-II涡旋混合器（天悦电子有限公司）。

1.4分组与造模将40只健康的SPF级SD雄鼠被毛染色编号、称体质量后按照随机数字表分为正常组、模型组、敷贴组和SASP组，每组10只。UC（脾肾阳虚证）大鼠模型建立方法参考课题组前期研究[5]：每天给予大鼠番泻叶、腺嘌呤分阶段灌胃，连续4周后于第29天禁食不禁水24 h，经麻醉后，将聚丙烯管插入大鼠肛门上段8 cm处，将TNBS按100 mg/kg（约TNBS原液0.2 ml/100 g）加体积分数50%乙醇混合制成的试剂充分注入大鼠肠腔，然后轻放回笼子，自由饮食饮水。正常组大鼠则同期给予相应剂量的9.0 g/L氯化钠注射液灌胃和灌肠处理。

1.5干预方法选穴定位参考郭义主编的《实验针灸学》中常用动物穴位定位法、拟人比照法[6]，大鼠穴位图谱[7]研制如下：中脘、气海、足三里、天枢。大鼠选定穴位后进行备皮，贴药后予鼠夹固定。正常组和模型组：给予巴布剂基质穴位敷贴加生理盐水（5 mL/kg）灌胃；敷贴组：溃结宁膏穴位敷贴加生理盐水（5 mL/kg）灌胃；SASP组：巴布剂基质穴位敷贴加SASP溶液（用生理盐水配成10 mg/mL的溶液）50 mg/kg灌胃。各组于造模结束后1周开始给药，每天1次，敷贴时间每次1～1.5 h，足三里、天枢每次贴一侧，左右交替，给药疗程均为28 d。

1.6指标检测与方法

1.6.1 标本采集 治疗完成后大鼠禁食12 h，腹腔注射麻醉，剪开腹壁，快速剖取结肠组织，并肉眼观察组织，对结肠大体形态和黏膜组织损伤作出评分。取病变肠段分别进行苏木素——伊红（HE）染色、RT-PCR实验及免疫组化等相关检测。1.6.2 一般情况观察 实验期间每天观察大鼠体质量、饮食饮水、大便形状及精神活动等一般状况。

1.6.3 结肠炎症评价指标 ①疾病活动指数（DAI）：结合大鼠性状，按DAI标准[8]进行评分。②结肠黏膜损伤指数（CMDI）：肉眼观察结肠组织，以正常、糜烂、溃疡分级描述，进行结肠组织大体形态损伤指数评分[9]。③结肠组织学损伤指数（TDI）：病变组织经HE染色后光学显微镜下观察组织病理学改变，进行结肠组织学损伤评分[10]。

1.6.4 免疫组化法检测TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达 TLR4阳性表达为胞质或胞膜内呈现棕黄色，MyD88阳性表达为胞质、胞膜或胞核呈现棕黄色，NF-κB阳性表达为细胞质和细胞核，以细胞核为主呈现，计算镜下照片中阳性区域的累积光密度（IOD）值。蛋白阳性表达强度以IOD值表示。

1.6.5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表达 Trizol提取结肠组织总RNA进行RT-PCR扩增。TLR4上游引物5’-TATCCAGAGCCGTTGGTGTATCT-3’，下游引物为5’-AATGAAGATGATGCCAGAGCG-3’，扩增片段为85 bp；MyD88上游引物为5’-CGAGGA GGACTGCCAGAAATAC-3’，下游引物为5’-CAG TAGCAGATGAAGGCGTCG-3’，扩增片段为177 bp；NF-κB上游引物为5’-GCTCCTTTTCTCAAGC CGATGT-3’，下游引物为5’-CGTAGGTCCTTTTG CGTTTTTC-3’，扩增片段为210 bp。95℃，15 s→60℃，60 s，循环40次。采用Image Lad凝胶成像系统软件获得灰度积分值，并与内参β-actin相比计算比率，其结果表示目的基因的相对表达水平（p）。

1.7统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，检验各组数据正态性及方差齐性，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性时用LSD法，方差不齐时用Tamhane’s法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般情况从造模第2周开始直至造模结束，大鼠相继出现神态萎靡，嗜睡懒动，毛发稀疏无泽，易脱毛，甚则拱背蜷缩聚堆，小便清长，大便变软，甚则粪便溏泻，肛门周围沾有污物，饮食及饮水量明显降低，体质量增长幅度较正常组大鼠明显减小，部分甚至出现腹部胀满。经过28 d治疗后，敷贴组及SASP组大鼠症状、体征均有不同程度改善，体质量增长，且饮食及饮水量增加，基本接近正常组。模型组大鼠症状体征持续，甚则加重，体质量较前继续下降，饮食及饮水量进一步减少。

2.2各组大鼠结肠炎症评分比较与正常组比较，模型组、敷贴组、SASP组疾病活动指数、结肠黏膜损伤指数及结肠组织损伤指数评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，敷贴组及SASP组大鼠疾病活动指数、结肠黏膜损伤指数及结肠组织损伤指数评分明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），但敷贴组与SASP组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠疾病活动指数、结肠黏膜损伤指数、结肠组织损伤指数评分比较Table 1 Comparison of the scores of DAI，CMDI and TDI in various groups （-x±s，s/分）

2.3各组大鼠结肠组织病理变化比较正常组：结肠黏膜、黏膜下层、肌层各层均未见明显异常，腺体结构清晰，无炎性细胞浸润。模型组：结肠黏膜呈缺损及坏死脱落状，形成溃疡灶，严重者深达黏膜下层，局部组织充血、水肿明显，伴中性粒细胞、淋巴细胞等大量炎性细胞浸润。敷贴组：黏膜缺损及溃疡较少，腺体结构排列尚规则，伴有炎性细胞少量浸润。SASP组：黏膜下毛细血管充血，黏膜下层稍有水肿，少量炎性细胞浸润。结果见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理变化比较（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of the pathologic features in colonic tissues of various groups（by HE staining method，×100）

2.4各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达比较与正常对照组比较，模型组、敷贴组及SASP组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB表达增强（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，敷贴组及SASP组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），但敷贴组与SASP组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

正常组：结肠组织仅有微量TLR4、MyD88表达，主要分布在黏膜下层和固有层炎性细胞胞质及胞膜中，NF-κB呈微弱表达，以细胞核为主。模型组：结肠组织TLR4、MyD88及NF-κB均呈强阳性表达，主要以结肠表面上皮细胞、单核细胞、浆细胞及中性粒细胞等炎性细胞为主要分布，TLR4、MyD88以胞质和胞膜为主，NF-κB以细胞核为主，染色呈弥漫或颗粒性深棕黄色或褐色粗颗粒分布。敷贴组、SASP组：结肠组织TLR4、MyD88及NF-κB均呈散在阳性表达，弱于模型组。结果见图2～4。

2.5各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达比较与正常组比较，模型组、敷贴组、SASP组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，敷贴组及SASP组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），但敷贴组与SASP组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

表2 各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达比较Table 2 Comparison of the expression of TLR4，MyD88，and NF-κB in colonic tissues of various groups (-x±s)

图2 各组大鼠结肠组织TLR4免疫组化结果（×200）Figure 2 The immunohistochemical results of TLR4 in colonic tissues of various groups（×200）

图3 各组大鼠结肠组织MyD88免疫组化结果（×400）Figure 3 The immunohistochemical results of MyD88 incolonic tissues of various groups（×400）

图4 各组大鼠结肠组织NF-κB免疫组化结果（×400）Figure 4 The immunohistochemical results of NF-κB in colonic tissues of various groups（×400）

表3 各组大鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达比较Table 3 Comparison of the mRNA expression of TLR4，MyD88，and NF-κB in colonic tissues of various groups （-x±s，p）

3 讨论

溃疡性结肠炎属于中医学“泄泻”、“痢疾”等范畴，《景岳全书》曰：“凡里急后重……而其病本，则不在广肠，而在脾肾”。正所谓脾主一身之运化，肾寓一身之真阳，泄泻日久，脾阳不振，土不制水，致肾阳不足，则不能温养脾胃……湿壅滞肠络，搏结气血，气血瘀滞，血败肉腐，内溃成疡，发为本病[11]。因此，本课题组负责人朱莹教授认为，UC虽病位在肠，但可累及脾肾之脏，脾肾阳虚是UC反复发病的根本病机。基于多年的临床经验及前期研究，课题组采用自制的溃结宁膏，结合穴位敷贴疗法治疗UC，临床效果显著。膏方以炮附子、细辛、丁香、延胡索、赤芍、生姜、白芥子等作为主要组成，炮附子、细辛、丁香温脾肾而散寒凝，延胡索、赤芍散瘀止痛，白芥子、生姜增强药物透皮性。在此基础之上结合经穴——脏腑相关理论选取中脘、气海、足三里、天枢作为敷贴主穴，循经络“联系上下，沟通表里”，共奏温肾暖脾、活血化瘀之效[12]。

现代医学对UC的发病机制尚未完全明确，随着黏膜免疫系统的深入研究，发现TLRs家族中的TLR4介导的信号转导通路是UC发病过程中的重要环节[13]。TLR4介导信号通路主要通过识别配体后再与其主要接头蛋白MyD88相结合进行胞内信号转导，最终导致关键转录因子NF-κB的激活，使效应细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）等细胞因子，从而破坏肠道免疫稳态，最终导致UC发生。目前已有研究表明TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与介导脾肾阳虚型UC的发病过程[14，15]。吴氏等[14]研究发现脾肾阳虚型UC大鼠模型结肠组织TLR4、NF-κB的基因与蛋白表达明显增强，与正常组差异显著，经“温肾暖脾，涩肠止泻”方药进行干预治疗后，脾肾阳虚型UC大鼠模型结肠组织TLR4水平呈下降趋势，且大鼠证候改善明显。

本实验结果显示，模型组大鼠一般情况、肠道炎症指数评分、病理组织学形态方面均较正常组差，结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达明显增高，提示模型组大鼠结肠组织炎症失调、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路则呈现高表达状态。敷贴组及SASP组大鼠一般情况、肠道炎症指数评分、病理组织学形态方面较模型组明显改善，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平下降，表明溃结宁膏穴位敷贴可有效治疗UC（脾肾阳虚型），其作用机制可能是通过抑制TLR4的表达，下调MyD88表达从而抑制NF-κB的活化，阻断TLR4介导信号通路的转导，从而减轻机体炎症反应。