牦牛奶渣蛋白肽的提取及其抗氧化活性研究
2019-09-12王高赵亮林诗洋黄艾祥
王高，赵亮，林诗洋，黄艾祥
(云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201)
牦牛奶渣是一种少数民族特色食品，是将牦牛全乳或者提制酥油后的脱脂乳加热到50～60℃，再加入皱胃酶或酸奶后经过滤、晒干而成，外观呈白色，烟熏储存后呈暗黄色，味道非常酸。奶渣中富含蛋白质、矿物质、乳糖及多种维生素，营养价值高[1]。林亚秋等[2]对牦牛奶渣营养成分进行了分析，其中脂肪和蛋白质含量分别为1.69%与63.92%，含有16种水解氨基酸，必需氨基酸占总氨基酸含量的46.76%。但目前对奶渣的研究及产品的开发有限，除自食和送宾客外，主要作牲畜饲料，利用价值较低，仅有少数进入市场转化为经济来源。郑旭华等[3]利用奶渣资源生产干酪素，并利用干酪素高营养、低脂肪、低胆固醇的特点生产仿制干酪、焙烤制品、糖果制品等[1,4]。施娅楠等[5]还对食品级干酪素的研制进行了研究，但关于香格里拉牦牛奶渣蛋白肽的研究未见报道。
乳蛋白肽具有抗血栓、促进矿物质元素吸收[6]、抗菌[7]等作用，其作为生物活性肽制成的功能性食品，有抗氧化、抗癌、抑菌、降血压、免疫调节等生理功能[8]。其中抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂质氧化以及与金属离子螯合等能力，有抗氧化作用[9]，可直接添加到食品中。目前对牦牛奶渣蛋白的蛋白肽含量、种类及活性方面的研究处于空白，本文使用酶解法对牦牛奶渣蛋白肽进行提取制备，利用响应面优化酶解工艺，确定其中蛋白肽的活性，以期为牦牛乳制品的深度开发和利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
贯筋藤蛋白酶，实验室自制[10]；牦牛奶渣干品，采自香格里拉高山牧场。谷胱甘肽标准品，北京北纳创联生物技术研究院；茚三酮溶液、1,10-菲罗啉，三氯乙酸溶液（TCA），索莱宝公司；2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海晶纯生化科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 单因素工艺设计
以牦牛奶渣水解度和肽得率为指标，筛选酶的添加量为6%、8%、10%、12%、14%、酶解时间为10min、30min、50min、70min、90min、酶解温度为45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、料液比为1:50、1:70、1:90、1:110、1:130（g/mL，奶渣量：加水量），分析对牦牛奶渣多肽含量及水解度的影响。
1.2.2 牦牛奶渣蛋白肽提取工艺响应面设计
利用响应面试验设计，并以单因素试验结果为参考，选取酶的添加量、酶解温度、料液比、酶解时间，进行4因素3水平的响应面试验设计，确定最优工艺参数（见表1）。
表1 响应面试验因素与水平设计表
1.2.3 牦牛奶渣蛋白肽测定
标准曲线绘制：分别吸取谷胱甘肽标准溶液（0.8mg/mL）0、1、2、3、4、5mL于试管中，向6支试管各加入3mL双缩脲试剂，蒸馏水定容至10mL，60℃水浴显色5min，冷却至室温后，第一管做空白对照，310 nm处测定吸光值。回归方程为：y=4.408x-0.1324（R2=0.9993；y为吸光值，x为谷胱甘肽浓度）。
测定：取2.5mL牦牛奶渣酶解液，加2.5mL三氯乙酸溶液，均匀混合，静置20min，再离心10min（3500rpm/min）。取上述溶液2.0mL于试管中，再加双缩脲试剂3.0mL均匀混合，60℃水浴显色5min，再离心（2000rpm/min，10min）取上清液，310nm处测定吸光值，计算多肽含量。
1.2.4 牦牛奶渣蛋白肽水解度测定
标准曲线绘制：称取3mg甘氨酸标准品，蒸馏水定容至100mL，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于试管中，加1mL茚三酮显色液，沸水浴加热15min，冷却至室温后，加入5mL 40%乙醇溶液均匀混合，放置15min，使用零号管调零，570nm处测定吸光值。回归方程为：y=0.0335x+0.0469（3～21μg/mL，R2=0.998；x为甘氨酸浓度，y为吸光值）。
水解度测定：取适当浓度的奶渣蛋白肽水解液1mL，加1mL茚三酮显色液，沸水浴持续加热15min，冷却至室温后，加5mL40%乙醇溶液均匀混合，室温放置15min，使用零号管调零，570nm处测定吸光值。
1.2.5 抗氧化活性测定
用冷冻干燥后的牦牛奶渣蛋白肽干粉和相同条件制备的干酪素酶解物[11]冻干粉，以相同条件进行各项抗氧化活性测定，测定时上样量为250mg，用10mL蒸馏水溶解，以此浓度为标准测定吸光值和各项抗氧化活性，对比牦牛奶渣蛋白肽与干酪素的抗氧化活性。
1.2.5.1 总抗氧化能力测定（TEAC）
参考Moyo等[12]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物样品溶于10mL蒸馏水，然后分别取100μL样品溶液于试管中并加入ABTS·+稀释工作液3.8mL，室温下反应6min，734nm处测定吸光度，蒸馏水替代样品溶液作为空白，蒸馏水代替ABTS·+稀释工作液进行调零。
式中：c为ABTS·工作液吸光度，cb为蒸馏水吸光度（调零），s为ABTS·自由基清除能力吸光度，sb为样品干扰试验吸光度（调零）。
1.2.5.2 还原能力测定
参考徐怀德等[13]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物样品溶于10mL蒸馏水，然后分别取2mL样品溶液于试管中并加入PBS 2.5mL，加入铁氰化钾溶液2.5mL，50℃水浴20min，加入2.5mL TCA溶液，5000rpm/min离心10min；取上清1mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL FeCl3溶液，700nm处测定吸光度，蒸馏水代替样品溶液进行调零。
1.2.5.3 DPPH自由基清除能力测定
参考Lin等[14]的方法：取250mg牦牛奶渣蛋白肽和干酪素酶解物样品溶于10mL蒸馏水，然后分别取0.5 mL样品溶液于试管中并加入2mL DPPH溶液摇匀，室温下暗处放置10min，517nm处测定吸光值，蒸馏水代替DPPH溶液进行调零。
式中：s为DPPH·自由基清除能力吸光度，sb为样品干扰试验吸光度（调零），c为DPPH甲醇溶液吸光度，cb为蒸馏水吸光度（调零）。
1.2.6 数据处理
使用Excel 2010对数据进行统计分析及处理，利用Design-Expert-v8.0.6进行响应面分析。
2 提取工艺结果
2.1 牦牛奶渣蛋白肽的提取工艺
2.1.1 酶添加量对牦牛奶渣水解度和多肽含量的影响
设置不同酶的添加量，控制时间为50min，温度为65℃，料液比为1:30，对牦牛奶渣进行酶解，测定可以看出蛋白水解度和多肽含量，结果见图1。酶的添加量达到12%时多肽含量和水解度最高，故选取最适酶的添加量为12%。
图1 酶的添加量对水解度及多肽含量的影响
2.1.2 酶解温度对牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影响
图2 酶解温度对水解度及多肽含量的影响
设置不同酶解温度，酶的添加量8%，时间50min，料液比1:30，对牦牛奶渣进行酶解，测定蛋白水解度和多肽含量，结果见图2。可以看出，温度达到65℃时多肽含量和水解度最高，故选取65℃为最适酶解温度。
2.1.3 酶解时间对牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影响
设置不同酶解时间酶解温度65℃，料液比1:30，酶的添加量8%，对牦牛奶渣进行酶解，测定蛋白水解度和多肽含量，结果见图3。可以看出，酶解时间达到70min时，多肽含量和水解度最高，故确定70min为最优酶解时间。
图3 酶解时间对水解度及多肽含量的影响
2.1.4 料液比对牦牛奶渣蛋白水解度和多肽含量的影响
设置不同料液比，控制酶的添加量为8%，时间50min，温度65℃，对牦牛奶渣进行酶解，测定蛋白水解度和多肽含量，结果见图4。可以看出，料液比达到1:110时多肽含量和水解度最高，故选取1:110为最佳料液比。
图4 料液比对水解度及多肽含量的影响
综上所述，单因素试验中确定酶的添加量12%、酶解温度65℃、酶解时间70min、料液比1:110为最优。
2.2 响应面优化的工艺参数
2.2.1 响应面优化及结果
根据单因素试验结果，建立Box-Behnken Design中心组合设计试验模型，通过拟合二次方程计算最优工艺组合及牦牛奶渣蛋白肽的最大理论提取量。选择料液比（A）、酶的添加量（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）进行4因素3水平响应面实验，结果见表2。
2.2.2 模型建立及显著性检验
利用Design-Expert-v8.0.6软件，得到牦牛奶渣水解度、多肽含量的二次方程模型为：
表2 响应面分析方案及结果
表3 回归模型方差分析表
由表3可知，水解度及多肽含量回归模型的显著性检验P＜0.0001达极显著水平；两个模型失拟性检验P＞0.05，可认为与实际试验拟合性充分模型失拟不显著，说明可信度高。水解度拟合C.V值为2.13%，多肽含量C.V值为0.93%，表示精确度高。因此，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确分析和预测酶解液的水解度及蛋白肽提取量，具有实际指导意义。该模型中，各因素对蛋白水解度影响顺序为：酶解时间＞料液比＞酶解温度＞酶的添加量，对蛋白肽提取率影响顺序为：料液比＞酶解时间＞酶的添加量＞酶解温度。
2.2.3 响应面分析
图5 温度与时间的交互作用对水解度的影响
由图5可知，随着温度的上升，水解度呈上升的趋势，趋于平缓后下降；酶解时间与温度对水解度的影响相同。说明温度与时间交互作用对水解度影响显著，与方差分析结果相符。
图6 时间与酶添加量的交互作用对水解度的影响
由图6可知，随着时间的增加，水解度呈上升趋势，但随后趋于平缓；而酶添加量与料液比对水解度的影响相同。说明时间与酶添加量交互作用对水解度影响显著，与方差分析结果相符。
图7 温度与时间的交互作用对多肽含量的影响
由图7可知，随着温度的上升，多肽含量呈上升趋势，但随后下降；而酶解时间对多肽含量的影响，先呈上升趋势后下降。说明温度与时间的交互作用对多肽含量影响显著，与方差分析结果相符。
图8 料液比与时间的交互作用对多肽含量的影响
由图8可知，随着料液比的增加，多肽含量先呈上升趋势后下降；而酶解时间对多肽含量的影响呈上升趋势，但随后趋于平缓。说明料液比与时间交互作用对多肽含量影响显著，与方差分析结果相符。
图9 时间与酶添加量的交互作用对多肽含量的影响
由图9可知，随着时间的增加，多肽含量呈上升趋势，但随后趋于平缓；而酶添加量对多肽含量的影响，先呈上升趋势后下降。说明时间与酶添加量交互作用对多肽含量影响显著，与方差分析结果相符。
2.2.4 最佳参数确定和回归模型验证
表4 最佳参数确定和回归模型验证
通过响应面法得到的最佳工艺条件：酶解温度61.52℃，酶解时间74.21min，料液比1∶107g/mL，酶的添加量为11.91%。结合实际操作的简便性，调整为：酶解温度65℃，料液比1∶110g/mL，酶解时间70min，酶的添加量为12%。此时水解度预测值为14.276%，多肽含量预测值为21.2095mg GSH当量/mL。在此条件下进行验证试验，得到水解度为（14.06±0.07）%，多肽含量为：（20.81±0.051）mg GSH当量/mL，与理论值接近，说明得到的优化参数准确性高。
2.3 牦牛奶渣蛋白肽抗氧化活性
表5 牦牛奶渣蛋白肽与干酪素酶解液抗氧化活性
由表5可知，所得牦牛奶渣蛋白肽的ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及还原能力（RP）均高于干酪素酶解液，由此可知，牦牛奶渣蛋白肽的体外抗氧化活性强于干酪素酶解液。
3 结论
经试验得到的利用贯筋藤凝乳酶酶解牦牛奶渣提取牦牛奶渣蛋白肽的最佳工艺为：牦牛奶渣超微粉碎机粉碎→超声破碎（300w，20min）→振荡水浴锅中酶解（时间70min、料液比为1:110g/mL、温度65℃、酶的添加量为底物质量的12%）→离心（4000rpm/min，15min）→取上清液→冷冻干燥（5～10MPa，-50℃）→牦牛奶渣蛋白肽。其ABTS自由基清除能力为195.13±1.83μg GSH当量/g；DPPH自由基清除能力为61.63±1.12μg GSH当量/g；还原能力为108.6±0.49μg GSH当量/g。表明牦牛奶渣蛋白肽具有一定还原能力及自由基清除活性，是一种潜在的抗氧化剂。
