γ辐照对指状青霉的抑制作用及在柑果实保鲜中的应用

刘 红,黎 琴,胡尚连,王 丹,陈 浩,黄 敏,赵 博,,*

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.辐照保藏四川省重点实验室,四川成都 610101)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)属芸香科(Rutaceae)植物,富含多种人体所需的营养成分和生物活性物质,具有较高营养价值[1-2]。在我国,随着其种植面积和产量的快速增长,柑橘已成为重要的优势经济农产品之一,且90%以上以鲜销为主[3]。然而由于柑橘成熟期集中、主产区偏远,故需要一定的贮藏和运输手段来调节市场供求。在采后贮藏期间,柑橘常常由于腐烂造成极大的经济损失[4-5],而造成柑橘果实在采后腐烂的主要原因是真菌引起的侵染性病害,如青霉病、绿霉病、炭疽病等,其中,由指状青霉(Penicilliumdigitatum)引起的绿霉病危害最大[6-8]。目前,生产上用于防治柑橘采后病害的手段有生物防治[9-11]、化学防治[5,12]、物理防治[13-15]等。其中以化学防治为主,但长期使用化学杀菌剂不仅会使病原微生物产生抗药性,还会导致果实中药物残留而危害人体健康,因此寻找生态友好、安全可靠的保鲜技术替代化学杀菌剂日益迫切[16-17]。

辐照灭菌技术作为一种新兴有效的技术,引起了许多研究者的关注,且在很多领域得到大量应用[18-20]。辐照灭菌技术是指利用各种射线或电子束等杀灭微生物的过程[21]。γ-辐照是电离辐射中能量最高的一种形式,广泛应用于食品灭菌[22-23]、食品保鲜[24-26]、毒素降解[27-28]、食品加工[29-30]以及诱变育种[31]等。同时γ-辐照还具有无残留、无污染、低能耗、安全卫生等优点。

本研究通过γ-辐照的手段来处理指状青霉,通过检测辐照后指状青霉的生长情况、细胞膜渗透性、总糖、可溶性蛋白质含量以及苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性,探究γ-辐照对指状青霉生长及其代谢的影响,并以椪柑果实为例,研究γ-辐照对其保鲜效果的影响,为γ-辐照技术在柑橘采后贮藏保鲜上的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

椪柑果实 采自绵阳市河边镇一管理良好的果园;指状青霉病菌 中国农业微生物菌种保藏管理中心;苹果酸脱氢酶测试盒、琥珀酸脱氢酶测试盒 南京建成生物工程研究所;其它所需化学试剂 (分析纯)国药集团化学试剂成都有限公司;PDA培养基、PDB培养基 实验室自制。

BS-4G恒温培养振荡箱 金坛市精达仪器制造有限公司;5702R超速离心机 Eppendor公司;雷磁DDSJ-319L型电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;HH-2恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司;BSA-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;EU-2200紫外分光光度计 上海昂拉仪器有限公司;HHS-1000超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;MLS-3750高压灭菌锅 三洋电机株式会社;GXH-3010E便携式红外线CO2分析仪 北京华云分析仪器有限公司;糖度计0～50%手持折光仪 浙江力辰仪器科技有限公司;60Coγ-射线辐照处理 中国工程物理研究院核物理与化学研究所辐照中心。

1.2 实验方法

1.2.1 指状青霉菌种活化及分生孢子悬浮液的制备 在无菌环境下,挑取指状青霉白色菌丝少许,接种于制备好的PDA培养基上,置于28 ℃恒温箱中,培养7 d后,即得活化的指状青霉菌种。在无菌条件下,使用接种环将培养皿中全部菌种集中于角落(期间可加无菌水便于集中),倒入含玻璃珠的无菌三角瓶,无菌水冲洗残渣,得5 mL孢子原液;随之手摇三角瓶(打散孢子);再将纱布放在漏斗上,并用脱脂棉堵住漏斗洞口,过滤;最后,用无菌水过滤残渣,稀释即得25 mL分生孢子悬浮液(菌悬液)。

1.2.2 辐照处理 分别用强度为0.25、0.50、0.75、1.00 kGy的γ-射线对稀释菌悬液进行辐照,辐射源强度为2.3×105Ci,剂量率约为33 Gy/min,辐照处理时间约为120 min,辐照强度为吸收剂量,未做辐照处理的稀释菌悬液作为空白对照。

1.2.3 辐照对指状青霉生长的影响 将经不同强度γ-射线辐照后的指状青霉菌悬液接种于PDA培养基上,未做辐照处理的稀释菌悬液作为空白对照,生长5 d后,借助直径为5 mm的无菌打孔器取指状青霉菌饼,移入PDA培养基,用镊子或接种针固定于PDA培养基正中位置,培养6 d后,利用十字交叉法测量指状青霉生长的纵径和横径,并用以下公式计算抑制率(%)。

式中:I为抑制率,%;l0为平皿直径,cm;l为菌落直径,cm。

1.2.4 辐照对指状青霉菌丝细胞膜渗透性的影响 在超净工作台中,加入1 mL菌悬液于100 mL PDB培养基中得稀释菌悬液,置于28 ℃恒温摇床振荡(160 r/min)培养2 d后进行辐照处理。辐照后立即取5 mL稀释菌悬液在超速离心机中离心(10000 r/min,15 min),取上清液用电导仪测电导率R0;剩下的继续摇床培养,并于1、2、3、4、5 h后取5 mL稀释菌悬液,离心测上清液电导率Ri(i=1,2,3,4,5),用以下公式计算相对电导率R(%)。

1.2.5 辐照对指状青霉菌丝的总糖含量的影响 在超净工作台中,加入1 mL菌悬液于100 mL PDB培养基中得稀释菌悬液,置于28 ℃恒温摇床振荡(160 r/min)培养5 d。辐照后继续摇床培养2 d后测定菌丝总糖含量[32],总糖测定采用蒽酮比色法,获得的标准曲线方程为y=0.2342x-0.055(y为糖质量，μg；x为吸光度),R2=0.9938。计算样品中总糖含量:

式中:S为总糖含量,%;C为蒽酮标准曲线获得的糖量,μg;D为稀释倍数;V1为提取液体积,mL;V2为测定时取用体积,mL;W为组织重量,g;106为样品重量单位换算常数,由g换算成μg。

1.2.6 辐照对指状青霉可溶性蛋白质含量的影响 样品处理过程同1.2.1,采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量[33]。

1.2.7 辐照对指状青霉菌丝苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性大小的影响 苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性测定依据测试盒进行,样品处理过程同1.2.1。

1.2.8 椪柑保鲜处理及指标检测 挑选着色均匀、大小适中、果形端正、无病虫斑以及无机械损伤的椪柑果实,分为五组,其中四组分别用强度为0.25、0.50、0.75、1.00 kGy的γ-射线辐照,另外一组为空白对照。辐照完成后,将处理组与空白对照组一同放置在常温下贮藏,每隔5 d进行各项指标检测。

1.2.8.1 椪柑果实失重率的测定 采用称量法进行椪柑果实失重率的测定。首先称量辐照前椪柑质量,然后每隔5 d称量辐照后椪柑质量,并通过以下公式计算椪柑在各时间段的失重率。

式中:S为失重率,%;m1为果实质量差,g;m2为果实质量,g。

1.2.8.2 椪柑果实呼吸强度的测定 采用红外分析仪进行呼吸强度的测定即用红外分析仪测定单位时间单位体积内读数的变化便为CO2的读数变化[34]。呼吸强度计算公式:

式中:R为呼吸强度,mg/(kg·h);C1为CO2起始浓度,mg/m3;C2为CO2终止浓度,mg/m3;V为玻璃干燥器体积,L;m为果实重量,g;t为测定时间,h。

1.2.8.3 椪柑果实可溶性固形物的测定 利用手持式折光仪测定[33]。

1.2.8.4 椪柑果实有机酸含量的测定 测定方法参照文献[33]。计算公式如下:

式中:S为有机酸含量,%;V为提取液总体积,mL;c为氢氧化钠滴定液浓度,mol/L;V1为滴定滤液消耗的氢氧化钠溶液体积,mL;V0为滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠溶液体积,mL;f为折算系数,g/mmol;Vs为滴定时所取滤液体积,mL;m为样品质量,g。

1.2.8.5 椪柑果实抗坏血酸含量的测定 测定方法参照文献[33]。计算公式如下:

式中:R为抗坏血酸含量,mg/100 g;V为样品提取液总体积,mL;V1为滴定滤液消耗的染料体积,mL;V0为空白滴定消耗的染料体积,mL;ρ为1 mL染料溶液相当于抗坏血酸的质量,mg/mL;Vs为滴定时所取样品溶液体积,mL;m为样品质量,g。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,实验数据采用Origin 8.5软件进行制图,并使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 γ-辐照对指状青霉生长的影响

图1为经γ-射线辐照后指状青霉的生长情况。从图1A和图1B可以看出,随着辐照强度的逐渐增大,指状青霉菌落直径逐渐减小,抑制率逐渐增加,各个辐照处理组的抑制率均显著高于对照(p<0.05)。尤其是当辐照强度为1.00 kGy时,其抑制率达到90%,如图1B所示。这表明,在一定的辐照强度范围内,γ-射线辐照能有效抑制指状青霉的生长,并且辐照强度越大,抑菌效果越佳。

图1 γ-辐照对指状青霉生长的影响Fig.1 Effects of γ-irradiation on the growth of Penicillium digitatum注:不同小写字母代表差异显著,p<0.05;图3～图4同。

2.2 γ-辐照对指状青霉菌丝细胞膜渗透性的影响

细胞膜作为菌丝体的保护屏障,对菌丝的正常生长起着至关重要的作用。当细胞膜被破坏时,内部电解质外泄,导致溶液电导率上升,故而培养液电导率的变化可以反映细胞膜渗透性的变化[35]。由图2可以看出,在一定强度的辐照范围内,随着辐照强度的增大以及辐照时间的延长,指状青霉培养液的相对电导率逐渐增大。并且四个辐照处理组的相对电导率均高于空白对照组,差异明显。这表明用一定强度的γ-射线辐照指状青霉,会使菌丝细胞膜破损,导致菌丝体内的内含物外渗至培养液中,使得培养液的相对电导率增大,并且辐照强度越大,对菌丝细胞膜的破坏越严重。

图2 γ-辐照对指状青霉菌丝细胞膜渗透性的影响Fig.2 Effects of γ-irradiation on cell membrane permeability of Penicillium digitatum

2.3 γ-辐照对指状青霉菌丝总糖和可溶性蛋白含量的影响

可溶性糖、蛋白质以及核酸贯穿整个细胞内部,它们的释放表明细胞膜结构受损,膜渗透性加大[36-37]。由图3可以看出,经不同强度辐照过的指状青霉,其菌丝体内的总糖与可溶性蛋白含量均显著(p<0.05)低于空白对照组。这表明在一定的辐照强度范围内,经过辐照的指状青霉,其菌丝体细胞膜受到破坏,渗透性增大,致使该菌丝体的内含物大量外泄,最终导致菌丝体本身所含总糖与可溶性蛋白含量减少。

图3 γ-辐照对指状青霉菌丝总糖(A)和可溶性蛋白含量(B)的影响Fig.3 Effects of γ-irradiation on total sugar(A) and soluble protein(B)content of Penicillium digitatum

2.4 γ-辐照对指状青霉菌丝苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性的影响

苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)是TCA循环中重要的氧化还原酶。MDH是糖代谢关键酶之一,该酶活性大小可作为衡量糖代谢的指标。SDH是线粒体功能反映的标志酶之一,该酶活性常作为TCA循环运行程度的指标[38]。由图4可以看出,经不同强度γ-射线辐照过的指状青霉,其菌丝体的苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性相比于对照均显著降低(p<0.05),并且辐照强度越大,酶的活性越低。这两种脱氢酶均是三羧酸循环过程中的关键酶,与菌丝体正常能量代谢有关,经过辐照后其活性大幅度下降,因此最终导致菌丝体细胞的生长受到严重影响。

图4 γ-辐照对指状青霉菌丝苹果酸脱氢酶(A)和琥珀酸脱氢酶(B)活性的影响Fig.4 Effects of γ-irradiation on the activity of malate dehydrogenase(A)and succinate dehydrogenase(B)of Penicillium digitatum

2.5 γ-辐照对椪柑果实保鲜效果的影响

2.5.1γ-辐照对椪柑果实失重率的影响 果实的失重率是判断保鲜效果的重要表观指标之一。经不同强度的γ-辐照处理的椪柑果实失重率如图5所示。通过对比发现,0.25、0.50 kGy的辐照对果实失重率影响并不明显,与对照相比无明显差异。而当辐照强度为0.75、1.00 kGy时,果实失重率高于对照组。这可能是过高的辐射强度对果实有一定伤害,造成表皮损伤,导致失重率相对过高。

图5 不同强度γ-辐照对椪柑果实失重率的影响Fig.5 Effects of different dose γ-irradiation on weight loss rate of Ponkan fruit

2.5.2γ-辐照对椪柑果实呼吸强度的影响 呼吸作用是园艺产品采后生理代谢的最主要过程,随着呼吸作用的进行,果实中的糖类等营养物质的不断被消耗,造成贮藏期果实品质不断下降。故而贮藏期果实的呼吸强度可直观的反映果实的生理代谢状况[39]。从图6可以看出,经不同强度γ-辐照处理以及对照果实的呼吸强度在贮藏期间总体上均呈下降趋势,这说明椪柑是典型的非跃变型果实。从图6中还可以看出,辐照处理可以明显刺激呼吸强度的增加,在贮藏刚开始的时候,各个辐照处理组果实的呼吸强度均高于对照组,但从第5 d以后,0.25、0.50 kGy两个处理组的呼吸强度和对照差异不明显。此外,0.75、1.00 kGy两个处理组的果实呼吸强度在整个贮藏前期(0～15 d)高于对照和其它各组,这可能由于是过高的辐照强度对果实造成伤害产生的伤呼吸所致。

图6 不同强度γ-辐照对椪柑果实呼吸强度的影响Fig.6 Effects of different dose γ-irradiation on respiration intensity of Ponkan fruit

2.5.3γ-辐照对椪柑果实品质的影响 有机酸、可溶性固形物及抗坏血酸均是果实营养物质,因此它们的含量可以直接反应果实的品质。从图7A可以看出,各处理以及对照椪柑果实在整个贮藏期间有机酸(TA)含量整体呈下降趋势,这与万春鹏等[39]的研究结果一致，主要是有机酸可以作为呼吸底物被消耗从而导致其含量随着贮藏时间的延长不断下降。在各个辐照处理组中,其中0.5 kGy辐照组的果实TA含量贮藏20 d明显高于对照组。这表明0.50 kGy的γ-辐照能有效延缓椪柑果实TA含量下降,使果实保持良好的品质。而1.00 kGy辐照组的果实TA含量甚至低于空白对照组,说明辐照强度过高导致果实代谢异常。

各处理以及对照组椪柑果实可溶性固形物含量的变化如图7B所示,所有处理组果实的可溶性固形物含量在整个贮藏期间除对照组外呈先上升再下降的趋势,这可能是由于在贮藏前期果实内多糖的水解过程占优势导致可溶性糖增加,贮藏中后期随着呼吸作用的不断消耗而导致可溶性固形物含量不断降低。其中0.50 kGy辐照组的果实在贮藏中后期可溶性固形物含量高于1.00 kGy辐照组和对照组。

从图7C可以看出,在整个贮藏期间,椪柑果实的抗坏血酸含量整体上呈先上升后下降的趋势。到贮藏中后期0.50 kGy辐照组的果实抗坏血酸含量最高,但各处理组与对照组之间差异不明显。因此,γ-辐照可以减缓椪柑果实有机酸、可溶性固形物及抗坏血酸的损失,保留更多的营养物质,从而保证椪柑品质。其中0.50 kGy辐照处理效果最佳。

图7 不同强度γ-辐照对椪柑品质的影响Fig.7 Effects of different dose γ-irradiation on quality of Ponkan fruit

3 讨论与结论

辐照作为一种处理手段,目前的研究集中在对真菌病原体生长的影响上[40]。据相关报道,辐照可有效抑制果实产品上的真菌群生长[41]。通过测量指状青霉经辐照后菌饼的大小表明,γ-辐照对指状青霉具有较强抑制作用,且在本研究的辐照强度范围内,抑制效果和辐照强度呈正相关,当辐照强度从0.25 kGy升高至1.00 kGy时,抑制率从20%升高至90%,这与王超等[42]在研究γ-辐照对低温火腿产品中初始微生物数量影响时获得的研究结果一致,即随着辐照强度的增加,产品中微生物数量显著减少。当辐照作用于病原菌菌丝体时,菌丝体的结构细胞膜渗透性增加,细胞膜结构受到破坏,导致胞内的内含物大量外泄,且辐照强度越大,作用越强,内含物外泄越严重,培养液的电导率越大,可溶性蛋白和总糖含量越低,当辐照强度从0.25升至1.00 kGy时,其总糖含量从0.26%降至0.04%,可溶性蛋白含量从0.12降至0.04 μg/g,彭旋等[32]在研究白薇提取液对意大利青霉菌丝细胞膜渗透性以及菌丝体可溶性蛋白和总糖含量的影响中也得到了一致的结果。本研究探讨了γ-辐照对指状青霉菌丝体苹果酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性的影响,发现经γ-辐照处理的指状青霉,其苹果酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性均有不同程度的降低,且辐照强度越大,两种酶活性越低,当辐照强度从0.25升至1.00 kGy时,其苹果酸脱氢酶活性从1.10降至0.35 U,琥珀酸脱氢酶活性从30.50降至4.00 U,降低了该菌丝体的能量代谢水平,从而影响其正常生长。

通过对椪柑果实的保鲜试验发现,利用一定强度的γ-辐照处理椪柑果实可以延缓其有机酸、可溶性固形物以及抗坏血酸的降解,减少椪柑中营养物质的流失。但对果实失重率和呼吸强度的影响不明显。且过高强度的γ-辐照会对果实造成一定的伤害,导致其代谢异常,果皮表面出现褐色斑点。因此,利用γ-辐照对柑橘类果实保鲜一定要控制好辐照强度。

综上所述,一定强度的γ-辐照能够通过破坏细胞膜的结构、影响相关酶的活性的方式来抑制指状青霉的生长,同时适宜强度的γ-辐照对椪柑果实具有一定的保鲜效果,是一种具有应用前景的优良保鲜技术。