基于拉曼光谱快速检测山西老陈醋醋泥中总黄酮方法的建立

李叶丽,温丹华,李 鑫,黄登宇

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西大学食品药品快检技术中心,山西太原 030006;3.山西省食品药品监督管理局,山西太原 030031)

老陈醋,作为山西省地标产品之一,历史悠久,其色泽深褐、醋香浓郁、酯香醇厚、过夏不腐、入冬不冻。研究表明食醋具有抗疲劳、调节血糖、血脂、降血压、抗氧化等多种生理功能[1]，品牌价值不言而喻,然而掺假、勾兑现象时有发生,因此,对其进行品牌保护,加强一线快速检测,提高检测的速度与准确率具有极其重要的意义[2-3]。

总黄酮作为山西老陈醋新增重要质量评价和特征指标之一,可以用来鉴假、识伪[4]。目前,对于总黄酮检测,多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法[5-8],但是该方法滴定试剂多,需要熟练的操作人员,不利于基层人员一线使用。因此建立快速检测技术尤为必要。拉曼光谱快速检测技术作为一种快速检测技术,是光照射在被测分子上发生非弹性散射,与被测分子之间发生能量交换,光子除运动方向发生变化之外,其频率也发生变化,这种频率的变化只与分子的振动与转动频率有关。正是利用这种特性,实现对物质的定性定量检测[9-10]。该技术具有样品无需前处理、操作简便、时间短、灵敏度高等优点,可以实现样品快速、无损伤、定性定量检测分析,最大的优点是水的拉曼散射很微弱,所以拉曼光谱检测技术是研究含水体系的理想工具[11],现已广泛应用于食品分析检测中[12-14]。

本试验尝试使用便携式拉曼检测仪对山西老陈醋醋泥中总黄酮进行定量检测,以黄酮类物质在其拉曼特征峰处强度为指标,优化积分时间、激光功率、积分次数,以期建立老陈醋中总黄酮的拉曼光谱数据库,同时拓展拉曼光谱仪的适用范围,为实现山西老陈醋一线质量安全监管提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山西老陈醋醋泥 山西宁化府醋厂提供;芦丁(HPLC≥98%) 北京索莱宝科技有限公司;NaNO2天津市德恩化学试剂有限公司;Al(NO3)3天津市耀华化学试剂有限责任公司;NaOH 天津市大陆化学试剂厂;CH3CH2OH 天津市风船化学试剂厂;硼砂(纯度≥99.5%) 天津市天大化工实验厂;Ca(OH)2(纯度≥95.0%) 中国医药公司北京采购供应站;ACN(前处理试剂)、纳米增强检测试剂(OTR103、OTR202) 苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司;化学试剂 均为国产分析纯。

BSA224S电子天平(d=0.01 g) 德国Sartorius公司;SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;UPT-I-10T超纯水器 四川优普超纯科技有限公司;PB-10 pH计 德国Sartorius公司;KQ-300DE超声波仪 昆山市超声仪器有限公司;UV-1600紫外/可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;RamTracer-200-QCM便携式拉曼光谱仪 苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗提取及纯化醋泥中总黄酮 准确称取山西老陈醋醋泥2.0 g,3000 r/min离心10 min,弃上清液,取沉淀。加入60%乙醇30 mL,保鲜膜封口,50 ℃、60 W超声50 min,3000 r/min离心20 min,弃沉淀,上清液即老陈醋醋泥中总黄酮粗提液[15-17]。

加入3倍体积饱和Ca(OH)2溶液及少量3%硼砂溶液调整提取液pH至8～9,将其处理液离心并取其上清液,实现对总黄酮粗提液的纯化[18-19]。

1.2.2 总黄酮拉曼光谱快速检测方法的建立 常温下取1.2.1纯化后溶液20 μL,依次加入500 μL OTR202,100 μL OTR103,振荡混匀,在积分时间20 s,积分次数10,激光功率300 mW条件下上机检测,用air-PLS方法去荧光背景处理[20],Origin 7.5进一步平滑处理,平滑系数为20。

1.2.3 选取总黄酮拉曼特征峰 配制芦丁储备液(2.0 mg/mL),将芦丁储备液、样品溶液及芦丁与样品混合溶液(体积比为1∶1),按1.2.2步骤进行检测。

1.2.4 建立拉曼光谱快速检测法标准曲线 将芦丁储备液分别稀释到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,按1.2.2步骤进行操作,以特征峰位置峰强度为纵坐标,芦丁质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,得出线性方程。

1.2.5 拉曼快速检测条件优化 通过单因素试验确定最佳积分时间、激光功率和积分次数。

1.2.5.1 优化积分时间 取20 μL样品溶液6份,固定积分次数10次,激光功率300 mW,分别设置积分时间为5、10、15、20、25、30 s,重复三次。考察不同积分时间下总黄酮拉曼特征峰强度。

1.2.5.2 优化激光功率 取20 μL样品溶液7份,积分时间用1.2.5.1中选定条件,固定积分次数10次,分别设置激光功率为50、100、150、200、250、300、350 mW,重复三次。考察不同激光功率下总黄酮拉曼特征峰强度。

1.2.5.3 优化积分次数 取20 μL样品溶液5份,积分时间用1.2.5.1中选定条件,激光功率用1.2.5.2中选定条件,分别设置积分次数为5、10、15、20次,重复三次。考察不同积分次数下总黄酮拉曼特征峰强度。

1.2.6 拉曼光谱快速检测方法学评价 对拉曼光谱快速检测方法精密度、重现性、稳定性及加标回收率进行测定。取总黄酮提取液1份,连续测定5次,评价方法精密度;取总黄酮提取液5份,分别测定,评价方法重现性。取总黄酮提取液1份,测定5次,每次间隔30 min,评价方法稳定性。取已知浓度的总黄酮提取液5份,分别加0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL的芦丁标品,进行检测,评价方法加标回收率。所有试验均在优化拉曼条件下,按1.2.2步骤进行操作。所有试验均重复三次,取平均值,依据特征峰处拉曼强度测定结果计算RSD值进行方法评价。

1.2.7 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法测定总黄酮

1.2.7.1 测定方法 吸取总黄酮提取液2.00 mL(两份),分别加入1.00 mL NaNO2溶液(50 g/L),混匀,静置6 min;分为试验组和对照组,实验组中加入1.00 mL Al(NO3)3溶液(100 g/L)并振荡混匀,对照组中不添加,静置6 min;分别加入4.00 mL NaOH 溶液(200 g/L),振荡混匀,静置15 min。以对照组调节零点,在波长510 nm 处,测定试验组吸光度[4]。

1.2.7.2 建立NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法标准曲线 准确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL芦丁标准使用液(相当于0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg无水芦丁),补dH2O至10 mL。按1.2.7步骤进行操作,以吸光度为纵坐标,芦丁质量为横坐标,绘制标准曲线,得出回归方程。

1.2.7.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法方法学评价 对NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法精密度、重现性、稳定性及加标回收率进行测定。根据1.2.6拉曼光谱快速检测方法学评价试验进行操作,所有试验均重复三次,取平均值。

1.3 数据处理

本试验数据主要采用Microsoft Office Excel和Origin 7.5软件进行数据处理和作图分析。

2 结果与分析

2.1 拉曼光谱快速检测方法实验结果

2.1.1 拉曼特征峰确定 731 cm-1处为山西老陈醋醋泥中黄酮类物质拉曼特征峰[21-23]。由图1可见,醋泥试样中黄酮类物质拉曼峰相对于芦丁峰位置发生了偏移,其原因可能是醋泥中所含物质为芦丁衍生物,且混合物中各物质之间存在相互影响,导致拉曼特征峰位置发生一定程度偏移。

图1 拉曼特征峰的选取Fig.1 Selection of Raman characteristic peaks

2.1.2 拉曼光谱快速检测方法标准曲线的建立 根据1.2.4步骤进行操作,建立的标准曲线,回归方程为y=76.73575x+32.93431,R2=0.86903,结果表明,在特征峰位置处,芦丁浓度与拉曼峰强度之间呈良好的线性关系。

2.1.3 最佳检测条件确定

2.1.3.1 积分时间确定 由图2可见,当积分时间为25 s时,其拉曼特征峰处拉曼强度最大。其原因可能是当积分时间小于25 s时,随激光照射时间的延长,所产生的拉曼效应愈明显,当激光照射时间达到一定阈值点后,所产生的热效应对老陈醋醋泥中黄酮类物质有一定程度破坏,使得拉曼效应降低。因此,选择25 s为最佳积分时间。

图2 积分时间的优化Fig.2 Optimization of integration time

2.1.3.2 激光功率确定 由图3可见,随激光功率不断增大,在特征峰处拉曼强度也持续上升。当激光功率为350 mW时,特征峰强度达到最大,峰最明显。其原因可能是黄酮类物质拉曼信号很弱,需要足够强的激光功率照射才能得出良好的图像。因此,选择350 mW为最佳激光功率。

图3 激光功率的优化Fig.3 Optimization of laser power

2.1.3.3 积分次数确定 由图4可见,不同积分次数在特征峰位置处所产生的拉曼特征峰基本重叠,可见积分次数对拉曼图像影响较小,因此选择积分次数最少,即5次为宜。

图4 积分次数的优化Fig.4 Optimization of integration times

2.1.4 拉曼光谱快速检测方法评价 根据1.2.6拉曼光谱快速检测方法学评价实验,对同一样品连续测定五次,测得特征峰峰强分别为361.99、333.92、276.81、379.59、336.62,计算得出RSD值为7.82%,说明准确度较高;测定5组相同样品,测得特征峰峰强分别为310.77、318.24、352.72、302.11、326.12,计算得出RSD值为4.33%,说明重复性较好;对一个样品测定5次,每次间隔30 min,测得特征峰峰强分别为336.93、354.22、316.21、341.19、332.61,计算得出RSD值为4.11%,说明稳定性较高;对已知浓度的总黄酮溶液加标,其测定结果如表1所示。

表1 拉曼光谱快速检测方法的加标回收率Table 1 The recovery rate of the method of Raman fast detection

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法实验结果

2.2.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法标准曲线的建立 根据1.2.7.1步骤建立的标准曲线方程为y=0.4287x+0.0034,其中y为吸光度,x为芦丁的质量,R2=0.9973,表明二者线性关系良好。

2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法评价 根据1.2.7.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法评价试验结果计算得出,该方法的精密度、重现性、稳定性的RSD值分别为0.55%,2.98%,5.31%,平均回收率为97.99%,表明该方法精密度很高,重现性、稳定性都较好,加标回收率也较高,方法可行。

2.3 方法比较

拉曼光谱快速检测方法与比色法结果比较如表2所示。与比色法相比较而言,拉曼光谱快速检测方法精密度及重现性均较差,但稳定性及加标回收率相对更高。从整体来看,新建立的拉曼光谱快速检测方法满足了一线检测的要求,可以实现现场快速检测。

表2 拉曼光谱快速检测方法与比色法比较Table 2 Comparison between the method of Raman fast detection and colorimetry

3 结论与展望

本试验建立了山西老陈醋醋泥中总黄酮拉曼光谱快速检测方法,确定总黄酮拉曼特征峰在731 cm-1处。通过拉曼条件优化试验,确定积分时间为25 s,激光功率为350 mW,积分次数为5次,此条件下进行测定,其拉曼特征峰最为明显。通过拉曼方法评价试验,结果显示其精密度、重现性、稳定性的RSD值分别为7.82%、4.33%、4.11%,平均加标回收率为98.75%。虽然与NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系比色法相比,其精密度及重现性较差,可靠性较低,但同时也表明该方法稳定性及加标回收率较好。总体而言,新建立的拉曼光谱快速检测方法达到了快速检测要求,可以实现现场快速检测。

本试验旨在通过建立山西老陈醋醋泥中总黄酮拉曼光谱快速检测方法,拓展拉曼检测仪的适用范围,为实现山西老陈醋拉曼光谱快速检测提供方法依据,为进一步实现山西老陈醋现场快速检测奠定基础。由于老陈醋醋泥中存在大量荧光物质对便携式拉曼检测仪干扰极大,如醇溶性蛋白等。所以,进一步试验中不仅需要在后期运用数学方法消除荧光背景,而且前期也要尽可能减少荧光干扰。可以尝试使用如大波长激光头或傅里叶变换拉曼等方法来消除荧光对实验结果的干扰。不断完善谱库,增强方法研究,提高拉曼快速检测技术的检出性能,便于更多新物质检测,这也是后续试验将要进一步研究的工作[24]。