GNM C78实时荧光PCR系统对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测

胡连霞,孙晓霞,陈启跃,周 巍,丁红田,刘立兵,付 琦,王建昌,*

(1.石家庄海关,河北石家庄 050051;2.河北省检验检疫科学技术研究院,河北石家庄 050051;3.北京金诺美生物技术有限公司,北京 100176;4.河北省食品检验研究院,河北石家庄 050071;5.河北省动物卫生监督所,河北石家庄 050081)

肉及肉制品是否掺假已成为食品安全检测和监管机构亟待解决的问题,依靠感官与经验的肉类形态学传统鉴别手段已远不能满足目前肉及肉制品掺假控制与监管的需要[1]。近年来,随着现代仪器分析[2]和分子生物学方法的不断发展,已逐步形成了以蛋白质检测和以核酸检测为基础的肉制品掺假鉴别方法体系[3-6]。以核酸为基础的检测方法主要通过区别动物种属间遗传信息的差异作为物种鉴别的检测靶点,该方法具有特异性高、方法便捷、不受组织类别限制等诸多优势,已逐渐在食品中肉类成分鉴别中占主导地位[7-10]。

以检测DNA为基础的动物源性成分检测方法主要有常规聚合酶链式反应(PCR)技术、多重PCR、DNA条形码、荧光定量PCR、微滴数字PCR方法等。而目前实时荧光PCR技术已经实现了对多种动物源性成分的快速检测[11-14],并且在日常检测中得到越来越多的应用,金萍等[15]建立的双重荧光PCR方法同时检测DNA混样中猪、鸡源性成分,适用于动物源性产品中猪、鸡源性成分的鉴别检测。侯东军等[16]建立的三重荧光PCR能够定性不定量的同时检出食品中鸭、牛、猪成分。曾少灵等[17]建立的多重实时荧光PCR方法能同时鉴别牛、山羊和绵羊源性3种成分,与国家标准方法相比灵敏10 倍,除了适用于饲料,还适用于肉品、奶制品、生皮和动物油脂等动物产品的牛、羊源性成分检测。虽然荧光PCR方法具有高效、系统、简便等特点,但多重荧光PCR对引物探针设计要求高,一个反应体系中过多的引物之间容易互相干扰,会导致扩增效率低,检测不准确[18],而且现有荧光PCR检测系统一次仅能进行一个条件相同的反应,无法满足肉及肉制品掺假中多种动物源性成分反应体系的不同反应条件的同时检测。

GNM C7-8实时荧光PCR系统(GNM C7-8)[19-20]采用液态薄膜金属涂覆陶瓷加热方式,具有高导热性,能够快速升降温,一般在40 min内完成扩增反应。GNM C7-8具有独立的8模块设计,每一模块设置独立的温控及光学检测系统,使得不同模块之间可以同时或不同时运行不同的扩增程序,而且每个模块的数据可以单独或同时分析处理。8模块设计的GNM C7-8实时荧光PCR系统的每个模块具有高灵敏度的4通道检测系统,分别为FAM、HEX、TxR和Cy5 4个通道的荧光激发和吸收波长,自动扫描,无需设定某一通道。进行多靶基因的同时检测时,无需考虑反应的先后顺序、不同体系的反应条件等,均可实现对样品多靶基因的同时实时监测和独立分析。

GNM C7-8模块间可同时或不同时运行针对不同靶基因的扩增条件,检测人员可以同时完成多个不同检测项目的测试,而互不干扰。到目前为止GNM C7-8实时荧光PCR系统主要应用于食源性致病菌的DNA检测研究,李静等[21]通过GNM C7-8实时荧光PCR系统建立了实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌的方法。李瑞等[22]运用GNM C7-8实时荧光PCR系统对大肠杆菌O157进行了实时荧光单引物等温扩增(SPIA)技术方法研究。王金凤等[19]成功建立了8种食源性致病菌的GNM C7-8实时荧光定量PCR同时检测方法。本研究应用GNM C7-8实时荧光PCR系统对四种人工模拟掺假肉制品中多种动物源性成分进行同时检测并与ABI7500实时荧光PCR系统检测的循环数和检测所需时间进行比较,以期得到同时检测所短时间的掺假检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛、驴、驼鸟、羊、猪、马、鸭、鸡、狐狸9种动物鲜肉 某市场;A1120 DNA Purification Kit试剂盒 Promega公司。

GNM C7-8实时荧光PCR系统 北京金诺美生物技术有限公司;ABI 7500实时荧光PCR仪 美国应用生物系统公司;Nanodrop 2000 C分光光度计 赛默飞世尔科技;SQ2119N西贝乐料理机 上海帅佳电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人工模拟掺假肉制品的制备 以日常生活中最常见的四种肉类:牛肉、驴肉、鸵鸟肉和羊肉作为基础,进行人工模拟掺假,制备掺假肉制品。具体制作如下:

将牛、驴、驼鸟、羊、猪、马、鸭、鸡、狐狸9种动物鲜肉,分别绞打成沫,于干燥箱中烘干成粉,分别收集于50 mL无菌干燥离心管中,4 ℃冷藏保存,备用。

根据国家或行业标准中检测动物源性成分的检出限[11-14],使掺假肉粉成分均在检出范围之内,分组如下:

第1组:1.5 mL离心管中49 mg牛肉粉中添加猪肉粉0.5 mg,鸭肉粉0.5 mg,得到掺假牛肉制品共50 mg。

第2组:1.5 mL离心管中49 mg驴肉粉中添加马肉粉0.5 mg,猪肉粉0.5 mg,得到掺假驴肉制品共50 mg。

第3组:1.5 mL离心管中49 mg鸵鸟肉粉中添加鸭肉粉0.5 mg,鸡肉粉0.5 mg,得到掺假鸵鸟肉制品共50 mg。

近段时间以来，受小麦市场上市量减少的影响，加之市场小麦价格持续走强，部分地区制粉企业已逐步开始采购拍卖粮以满足生产需求，国家临储小麦拍卖成交渐趋好转。

第4组:1.5 mL离心管中48.5 mg羊肉粉中添加鸭肉粉0.5 mg,狐狸肉粉0.5 mg,猪肉粉0.5 mg,得到掺假养肉制品共50 mg。

1.2.2 基因组DNA的提取 将4组掺假肉制品按照DNA Purification Kit试剂盒说明书提取DNA,测定DNA浓度,并稀释使所提取的DNA浓度为50～100 ng/μL,-20 ℃保存备用。

1.2.3 引物、探针的设计与合成 牛、驴、猪、马、狐狸5种动物源性成分所用引物和探针采用国家或行业标准[11-14],驼鸟、羊、鸡、鸭4种动物源性成分所用引物和探针自行设计(具体序列详见表1),均由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 引物和探针序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.4 实时荧光PCR的反应体系和反应条件 9种动物源性成分实时荧光PCR扩增体系均为25 μL[11-14],其中Premix Ex TaqTM12.5 μL,牛、驴、驼鸟、羊、猪、马、鸭、鸡源性成分上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,狐狸源性成分上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,牛、羊、驴、猪、马源性成分探针(10 μmol/L)1 μL,驼鸟、鸭、鸡、狐狸源性成分探针(10 μmol/L)0.5 μL,模板DNA 50～100 ng,用灭菌ddH2O补足25 μL体系。9种动物源性成分实时荧光PCR的反应条件[11-14]如表2所示。

表2 9种动物源性成分的实时荧光PCR反应条件Table 2 Real-time PCR reaction conditions for nine kinds of animal-derived ingredients

1.2.5 人工模拟掺假牛肉中动物源性成分的检测 将提取的人工模拟掺假牛肉DNA 70.9 ng/μL,取1 μL分别加入到牛源性、猪源性和鸭源性成分的反应体系中,并分别置于3个GNM C7-8模块中,按照表2,设置每个模块的反应条件,同时开始运行牛、猪和鸭源性成分扩增程序,分析每个模块中动物源性成分的检测情况。

同时以相同的反应体系和反应条件于ABI 7500上,分别进行牛、猪和鸭源性成分的检测,其检测结果与同GNM C7-8系统上的检测结果进行比较。

同时以相同的反应体系和反应条件于ABI 7500上,分别进行驴、马和猪源性成分的检测,其检测结果同GNM C7-8系统上的检测结果进行比较。

1.2.7 人工模拟掺假鸵鸟肉中动物源性成分的检测 将提取的人工模拟掺假鸵鸟肉DNA 93.2 ng/μL,取1 μL分别加入到鸵鸟源性、鸭源性和鸡源性的反应体系中,并分别置于3个GNM C7-8模块中,按照表2,设置每个模块的反应条件,同时开始运行鸵鸟、鸭和鸡源性成分的扩增程序,分析每个模块中动物源性成分的检测情况。

同时以相同的反应体系和反应条件于ABI 7500上,分别进行鸵鸟、鸭和鸡源性成分的检测,其检测结果与GNM C7-8的检测结果进行比较。

1.2.8 人工模拟掺假羊肉中动物源性成分的检测 将提取的人工模拟掺假羊肉DNA 97.6 ng/μL,取1 μL分别加入到羊源性、鸭源性、狐狸源性和猪源性的反应体系中,并分别置于4个GNM C7-8模块中,按照表2,设置每个模块的扩增程序,同时开始运行羊、鸭、狐狸和猪源性成分的扩增程序,分析每个模块中动物源性成分的检测情况。

同时以相同的反应体系和反应条件于ABI 7500上,分别进行羊、鸭、狐狸和猪源性成分的检测,其检测结果同GNM C7-8的检测结果进行比较。

1.3 数据处理

如有FAM荧光检出,且GNM C7-8系统的循环数≤35.0,则判定样品含有相应的动物源性成分,并且循环数越小,扩增起峰时间越短,说明系统灵敏度越高。

2 结果与分析

2.1 人工模拟掺假牛肉中动物源性成分的检测

牛、猪、鸭3种动物源性成分在GNM C7-8系统中检测,结果良好,其扩增曲线如图1A所示。靶基因在GNM C7-8中均出现典型的扩增曲线,牛、猪、鸭源性成分扩增起峰的循环数分别为26、31、32。ABI 7500系统中(图1B～图1D),牛、猪、鸭源性成分扩增起峰的循环数分别为27、31、30。两种系统的的检测结果一致,GNM C7-8系统能够同时实现对牛、猪和鸭源性成分的独立检测,各反应模块之间互不干扰,同时获得阳性结果所需要时间明显少于ABI 7500。

图1 人工模拟掺假牛肉中牛、猪、鸭源性成分检测结果Fig.1 Detection results of bovine,porcine and duck-derived ingredients from artificial adulterated bovine meat注:1:牛源性成分扩增曲线;2:猪源性成分扩增曲线;3:鸭源性成分扩增曲线;A:GNM C7-8系统检测掺假牛肉、 猪肉、鸭肉中动物源性成分的图谱;B～D:分别为ABI 7500系统检测掺假牛肉、猪肉、鸭肉中动物源性成分的图谱。

2.2 人工模拟掺假驴肉中动物源性成分的检测

驴、马、猪3种动物源性成分在GNM C7-8系统中检测结果良好,其扩增曲线如图2A所示。靶基因在GNM C7-8中均出现典型的扩增曲线,驴、马、猪源性成分扩增起峰的循环数分别为15、29、32。ABI 7500系统中(图2B～图2D),驴、马、猪源性成分扩增起峰的循环数分别为19、27、32。两种系统的检测结果基本一致,GNM C7-8系统能够同时实现对驴、马和猪源性成分的独立检测,各反应模块之间互不干扰,同时获得阳性结果所需要时间明显少于ABI 7500。

图2 人工模拟掺假驴肉中驴、马、猪源性成分检测曲线Fig.2 Detection results of donkey,horse and porcine-derived ingredients from artificial adulterated donkey meat注:1:驴源性成分扩增曲线;2:马源性成分扩增曲线;3:猪源性成分扩增曲线;A：GNM C7-8系统检测掺假驴肉、 马肉、猪肉中动物源性成分的图谱;B～D：分别为ABI 7500系统检测掺假驴肉、马肉、猪肉中动物源性成分的图谱。

2.3 人工模拟掺假鸵鸟肉中动物源性成分的检测

鸵鸟、鸭和鸡3种动物源性成分在GNM C7-8系统中检测结果良好,其扩增曲线如图3A所示。靶基因在GNM C7-8中均出现典型的扩增曲线,鸵鸟、鸭、鸡源性成分扩增起峰的循环数分别为25、30、32。ABI 7500系统中(图3B～图3D),鸵鸟、鸭、鸡源性成分扩增起峰的循环数分别为27、31、31。两种系统的检测结果基本一致,GNM C7-8系统能够同时实现对鸵鸟、鸭和鸡源性成分的独立检测,各反应模块之间互不干扰,同时获得阳性结果所需要时间明显少于ABI 7500。

图3 人工模拟掺假鸵鸟肉中鸵鸟、鸭、鸡源性成分检测曲线Fig.3 Detection results of ostrich,duck and chicken-derived ingredients from artificial adulterated ostrich meat注:1:鸵鸟源性成分扩增曲线;2:鸭源性成分扩增曲线;3:鸡源性成分扩增曲线;A:GNM C7-8系统检测掺假鸵鸟肉、 鸭肉、鸡肉中动物源性成分的图谱;B～D：分别为ABI 7500系统检测掺假鸵鸟肉、鸭肉、鸡肉中动物源性成分的图谱。

2.4 人工模拟掺假羊肉中动物源性成分的检测结果

羊、鸭、狐狸和猪4种动物源性成分在GNM C7-8系统中检测结果良好,其扩增曲线如图4A所示。靶基因在GNM C7-8中均出现典型的扩增曲线,羊、鸭、狐狸、猪源性成分扩增起峰的循环数分别为24、30、25、29。ABI 7500系统中(图4B～图4E),羊、鸭、狐狸、猪源性成分扩增起峰的循环数分别为25、31、25、31。两种系统检测结果一致,GNM C7-8系统能够同时实现对羊、鸭、狐狸和猪源性成分的独立检测,各反应模块之间互不干扰,同时获得阳性结果所需要时间明显少于ABI 7500。

图4 人工模拟掺假羊肉中羊、鸭、狐狸、猪源性成分检测结果Fig.4 Detection result of ovine,duck,fox and porcine-derived ingredients from artificial adulterated ovine meat注:1:羊源性成分扩增曲线;2:鸭源性成分扩增曲线;3:狐狸源性成分扩增曲线;4:猪源性成分扩增曲线;A:GNM C7-8系统检测掺假羊肉、鸭肉、狐狸肉、猪肉中动物源性成分的图谱;B～E:分别为ABI 7500系统检测掺假羊肉、鸭肉狐狸肉、猪肉动物源性成分的图谱。

3 结论与讨论

本研究基于GNM C7-8实时荧光PCR系统,实现了对牛肉、驴肉、鸵鸟肉和羊肉等4组人工模拟掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测。在GNM C7-8系统中,4组掺假肉制品中不同动物源性成分在独立的反应模块中,能够得到同时检测,均显示扩增良好,与ABI7500实时荧光PCR检测结果一致,而且所需时间明显少于ABI7500。

为实现对肉制品中多种动物源性成分的同时检测,已经建立了系列基于基因芯片技术[23-24]和多重实时荧光PCR的方法[25-26]。虽然这些方法能够实现对多种动物源性成分的高通量检测,但基因芯片技术检测成本比较高,不易于基层普及,而多重实时荧光PCR方法对引物探针的设计要求较高,基因扩增易出现重合,出现某一或者几个基因扩增效率低,导致定量检测不准确,甚至出现定性也无法判定的情况。GNM C7-8系统的最大优势是基于模块化设计,每个模块可单独进行一个或多个靶基因的扩增反应,且互不干扰。本研究中,GNM C7-8可以实现多种不同动物源性成分的同时检测,而且只需要针对单一动物源性成分进行检测条件的优化设计,不仅能降低引物设计难度,降低合成成本,也能获得最佳的检测灵敏度和特异性。

GNM C7-8实时荧光PCR系统能够满足重大公共安全卫生事件、突发食品安全事件和口岸快速通关等领域的多靶基因快速检测需要,实现快速响应检测,为保障食品安全提供有力的设备支撑。