玫瑰茄花色苷微胶囊的制备及其稳定性与释放性的评价

孟翔宇,赵彦巧,李钰琨,李亚琴,肖 红,肖 瑶,杨梦龙

(天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134)

玫瑰茄(Hibiscussabdariffa)是一种珍贵的药食同源植物[1],其花萼含有丰富的花色苷、酚类、氨基酸、有机酸和矿物质等多种营养成分[2]。研究表明,花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管和提高免疫等功效[3-6],但其易受pH、温度、光照和金属离子等因素影响而发生降解[7-8],限制了其在食品和医药领域的应用。目前,有关玫瑰茄花色苷的提取工艺、性质及用途的研究很多,但是增加玫瑰茄花色苷稳定性的研究较少。

海藻酸钠是从天然褐藻中提取的一种线性阴离子高分子多糖,其稳定性、增稠性、成膜性和絮凝性良好;壳聚糖是一种天然的碱性直链阳离子聚合多糖,生物相容性好,在体内能被多种酶生物降解、无毒、无抗原性。因此,海藻酸钠和壳聚糖已成为生物医学等领域广泛应用的高分子生物材料,是微胶囊采用的理想壁材。当前大多数研究多选用喷雾干燥法制备微胶囊,其方法存在不足:制备条件设置高温,在最初很容易破坏花色苷结构、操作不便、流速难控制、成本高。锐孔法是指利用注射器或滴管等器具,将充分溶解混匀的壁材和芯材滴加到氯化钙凝固浴中,使其在固化剂中快速固化形成微胶囊的方法。此项技术操作简便、制备条件温和、成本低,属于环境友好型技术。目前,已有研究采用锐孔法对猕猴桃油[9]、还原型谷胱甘肽[10]和红枣色素[11]等物质进行微胶囊化。陈虎等[12]对比研究了黑果枸杞中微胶囊化与未微胶囊化花色苷的稳定性与释放性,结果表明,微胶囊化能有效提高花色苷的性质。梅薇等[13]研究了锐孔法制备玫瑰花花青素的工艺条件,考察壁材浓度和针头孔径对工艺的影响,结果表明,制备的玫瑰花花青素微胶囊有很高的包埋率。史同瑞等[14]研究了壳聚糖-海藻酸钠微胶囊的形成机理及制备方法。前人的理论研究为以后的天然产物微胶囊化研究奠定了基础,提供了依据。但采用锐孔法制备玫瑰茄花色苷微胶囊的研究以及微胶囊化花色苷的稳定性及释放性在国内外鲜见报道。

本研究采用锐孔法制备玫瑰茄花色苷微胶囊。并利用红外光谱仪对花色苷微胶囊进行结构和成分分析;考察不同温度和光照条件下,微胶囊前后花色苷的稳定性,并对微胶囊化花色苷在模拟人工胃、肠液中释放效果进行研究,以期提高玫瑰茄花色苷利用率和附加值提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玫瑰茄 云南武定;果胶酶 500 U/mg,上海源叶生物科技有限公司;海藻酸钠 AR,北京市旭东化工厂;无水氯化钙 AR,天津市江天化工技术有限公司;壳聚糖(BR,脱乙酰度≥85%) 美国Sigma试剂公司;柠檬酸钠 AR,天津市瑞金特化学品有限公司;柠檬酸 AR,天津市风船化学试剂科技有限公司;溴化钾 SP,天津市金贝尔科技有限公司;纯水 实验室自制。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器厂;UV-2802S型紫外可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;TENSORⅡ红外光谱仪 德国布鲁克;AX224ZH电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司;电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;0～150 mm游标卡尺 杭州华丰巨箭工具有限公司;超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;真空冷冻干燥系统 科仪创智(北京)科技发展有限公司;Milli-Q纯水机 美国Millipore。

1.2 实验方法

1.2.1 玫瑰茄花色苷的制备 将玫瑰茄花萼放置在烘箱内,40 ℃,干燥7 h,将烘干的玫瑰茄花萼粉碎,过40～60目标准筛,获取玫瑰茄粉。以纯水为提取溶剂,在液料比45∶1 mL/g,果胶酶添加量5 mg/g、水浴温度45 ℃的条件下酶解90 min,得到玫瑰茄花色苷提取液,经浓缩后冷冻干燥得玫瑰茄花色苷粉末[15]。

1.2.2 锐孔法制备玫瑰茄花色苷微胶囊工艺流程

1.2.2.1 海藻酸钠壁材溶液的配制 称取一定质量的海藻酸钠,加入蒸馏水,配制成一定质量分数的海藻酸钠溶液,备用。

1.2.2.2 芯材花色苷与壁材混合液的配制 根据壁芯比,称取一定质量的芯材加入壁材溶液中混合,备用。

1.2.2.3 凝固浴的配制 配制一定质量分数的壳聚糖溶液和一定质量分数CaCl2溶液,混合在一起制成凝固浴,备用。

1.2.2.4 花色苷微胶囊的制备 将凝固浴放置在磁力搅拌器上,设温度为25 ℃,用孔径为0.5 mm的5 mL注射器将芯壁混合溶液滴至凝固浴中,搅拌包埋30 min,包埋完成后,倒掉凝固浴,将微胶囊表面残留的凝固浴用纯水冲洗干净,抽滤至微胶囊表面无明显液体,将微胶囊倒入培养皿,放入烘箱中40 ℃干燥1 h,即得到微胶囊成品。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同壳聚糖质量分数对微胶囊包埋率的影响 在海藻酸钠质量分数为2.0%,CaCl2质量分数为2.0%,壁芯比2∶1 g/g,考察壳聚糖质量分数在0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%时的微胶囊包埋率。

1.2.3.2 不同CaCl2质量分数对微胶囊包埋率的影响 在海藻酸钠质量分数为2.0%,壁芯比2∶1 g/g,壳聚糖质量分数为0.1%的条件下,考察CaCl2质量分数在1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%时的微胶囊包埋率。

1.2.3.3 不同海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率的影响 在CaCl2质量分数为2.0%,壁芯比2∶1 g/g,壳聚糖质量分数为0.1%的条件下,考察海藻酸钠质量分数在1.6%、1.8%、2.0%、2.2%和2.4%时的微胶囊包埋率。

1.2.3.4 不同壁芯比对微胶囊包埋率的影响 在海藻酸钠质量分数为2.0%,CaCl2质量分数为2.0%,壳聚糖质量分数为0.1%的条件下,考察壁芯比在1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1和3.0∶1 g/g时的微胶囊包埋率。

1.2.4 响应面试验优化花色苷微胶囊包埋工艺 以海藻酸钠质量分数(A)、CaCl2质量分数(B)、壁芯比(C)、壳聚糖质量分数(D)为因子,以微胶囊包埋率(Y)为指标,进行响应面优化试验。响应面试验因素与水平见表1。

图1 锐孔法制备微胶囊装置示意图Fig.1 Device of microcapsule by Piecing Method

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.5 指标的测定

1.2.5.1 花色苷含量的计算

花色苷提取量(mg/100 g)=(ΔA×V×F×M×100)/(ε×1×W)

ΔA=(A520(pH1.0)-A700(pH1.0))-(A520(pH4.5)-A700(pH4.5))

式中:M为矢车菊素葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucoside)的分子量,449.2 g/mol;W为样品质量,g;V为提取液体积,mL;F为稀释倍数;ε为摩尔消光系数26900 L/(mol·cm);A为吸光度。

1.2.5.2 花色苷保留率的计算

式中：A1:包埋前测定花色苷含量时溶液吸光度；A2:包埋后测定花色苷含量时溶液吸光度。

1.2.5.3 微胶囊包埋率的计算

式中:M1为微胶囊总花色苷的含量,mg;M2为微胶囊表面花色苷的含量,mg。

1.2.5.4 微胶囊总花色苷含量的测定 称取0.2 g玫瑰茄花色苷微胶囊,加少量pH3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液[16],充分研磨。将破碎后的微胶囊放在漏斗中,用缓冲液冲洗过滤至10 mL容量瓶中,定容,计算花色苷含量[17]。

1.2.5.5 微胶囊表面花色苷含量的测定 称取0.2 g玫瑰茄花色苷微胶囊,放入漏斗中用75%乙醇溶液冲洗微胶囊,过滤至10 mL容量瓶中,定容,计算花色苷含量[17]。

1.2.6 颗粒形态观察 将制备的玫瑰茄花色苷微胶囊平铺在干燥的比色皿上,用眼睛观察其颗粒形态,并用游标卡尺测定微胶囊的直径。

1.2.7 红外光谱扫描分析 采用红外光谱仪结合KBr压片法分别对花色苷、微胶囊壁材及微胶囊化花色苷,在波长为400～4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描分析,分析样品的红外光谱图。

1.2.8 玫瑰茄花色苷微胶囊贮藏稳定性

1.2.8.1 温度对花色苷微胶囊稳定性的影响 取适量微胶囊化前后玫瑰茄花色苷,在避光条件下,分别置于具塞锥形瓶中,每隔7 d称取一定量微胶囊溶于pH3的缓冲溶液中,测定不同温度(4、25、50 ℃)下花色苷及花色苷微胶囊样品的保留率,监测35 d。

1.2.8.2 光照对花色苷微胶囊稳定性的影响 取适量微胶囊化前后玫瑰茄花色苷,室温分别置于具塞锥形瓶中,每隔7 d称取一定量微胶囊溶于pH3的缓冲溶液中,测定不同光照(避光、自然光)条件下花色苷及花色苷微胶囊样品的保留率,监测35 d。

1.2.9 玫瑰茄花色苷微胶囊体外缓释效果评价 人工胃、肠液的制备参照谢岩黎等[18]配制方法。

人工胃、肠液条件下的缓释效果评价:分别称取0.2 g花色苷微胶囊,加入盛有50 mL人工胃、肠液的锥形瓶中,在37 ℃、50 r/min条件下恒温振荡,每隔30 min测定释放率。花色苷微胶囊释放率按以下公式计算:

1.3 数据处理

以上各项实验重复3次。用Design-Expert V8.0.6软件进行数据分析,应用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 壳聚糖质量分数比对微胶囊包埋率的影响 不同壳聚糖质量分数对微胶囊包埋率的影响,如图2所示。

图2 壳聚糖质量分数对包埋率的影响Fig.2 Effects of chitosan concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由图2可见,随着壳聚糖质量分数的不断增大,在0.05%～0.25% 范围内,玫瑰茄花色苷包埋率先增加随后下降,当壳聚糖质量分数为0.1%时,包埋率最高,为97.1%，与0.05%相比增加明显。这是由于壳聚糖质量分数低于0.1%时,壳聚糖与海藻酸钠发生络合反应机会降低,破坏微胶囊成型效果。当壳聚糖质量分数超过0.1%时,壁材量过高,壁材之间碰撞的机会增加,而壁材芯材之间碰撞的机会减少,使包埋率降低[19]。因此,本研究选取壳聚糖质量分数为0.1%～0.2%进行后续研究。

2.1.2 CaCl2质量分数对微胶囊包埋率的影响 不同CaCl2质量分数对微胶囊包埋率的影响,如图3所示。

图3 CaCl2质量分数对包埋效率的影响Fig.3 Effects of CaCl2 concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由图3可见,CaCl2质量分数在1.0%～2.0%时,微胶囊包埋率增加,大于2.0%随着CaCl2质量分数的增加逐渐减小。这是由于CaCl2在整个包埋过程中发挥交联和固化的作用,CaCl2质量分数较小时,固化作用小,微胶囊呈片状而且包埋率低。当CaCl2质量分数较大时,CaCl2与海藻酸钠快速形成致密的交联结构,包埋过程中芯材的损失量少,但机械强度较大,降低缓释性能[20]。因此,本研究选取CaCl2质量分数范围为1.5%～2.0%。

2.1.3 海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率的影响 不同海藻酸钠质量分数对微胶囊包埋率的影响,如图4所示。

图4 海藻酸钠质量分数对包埋率的影响Fig.4 Effects of sodium alginate concentration on the entrapment efficiency of anthocyanins

由图4可见,海藻酸钠质量分数为2.2%时,玫瑰茄花色苷包埋率最高,为96.8%,之后随海藻酸钠质量分数增加,包埋率降低。这是由于海藻酸钠添加量过大时,配制成的溶液较粘稠,制囊时不易滴落,微胶囊呈椭圆形。当海藻酸钠质量分数为2.4%，包埋率只有86.7%。因此,本研究选取海藻酸钠质量分数为1.8%～2.2%。

2.1.4 壁芯比对微胶囊包埋率的影响 不同壁芯比对微胶囊包埋率的影响,如图5所示。

图5 壁芯比对包埋率的影响Fig.5 Effect of wall/core material ratio on the entrapment efficiency of anthocyanins

由图5可见,随着壁芯比逐渐递增,在1∶1～2∶1的范围内,玫瑰茄花色苷包埋率不断增大,2∶1～3∶1的范围内逐渐下降,当壁芯比为2∶1时,包埋率最高,为95.2%。这是由于壁材比例过少时,壁材不能完全包裹住花色苷,花色苷分散在微胶囊的表面,使花色苷容易损失[13],包埋率降低。当壁材比例过高时,由于滴注针管孔径不变,微胶囊包埋的有效成分会相对减少,微胶囊的品质会随之降低。因此,本研究选取壁芯比范围为1.1∶1～2.5∶1。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验方案及结果 根据2.1的实验结果,考察海藻酸钠质量分数(A)、CaCl2质量分数(B)、壁芯比(C)、壳聚糖质量分数(D)这4个主要影响因素。实验方案及结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface test

2.2.2 模型方程的建立与显著性试验 采用Design-Expert V8.0.6软件对响应面试验数据进行分析,得到玫瑰茄花色苷微胶囊包埋率与各因变量的模拟方程为:Y=+97.70+0.42A+0.74B-0.53C+0.29D-0.42AB-0.18AC+0.66AD+0.34BC-0.45BD+0.96CD-0.71A2-0.44B2-0.59C2-0.79D2。回归方程抛物面开口向下,具有极大值点,可以对玫瑰茄花色苷微胶囊工艺条件进行优化[21-22]。方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3可知,所得的回归方程模型项极显著(p<0.0001),且失拟检验不显著(p=0.1245>0.05),说明此回归模型理想,用方程拟合4个因素与包埋率之间的关系是可行的。决定系数R2=0.9223,说明包埋率的实测值与预测值之间有较好的拟合度。综合以上分析可知:该模型与实际情况拟合较好,可用于预测包埋率的变化情况。从对包埋率的影响来看,一次项B(CaCl2质量分数)对包埋率影响极显著(p<0.01),其余因素均有显著影响(p<0.05),根据F值可知,4个考察因素对包埋率的影响顺序为B>C>A>D;二次项对包埋结果均有显著影响(p<0.05),交互项BC、BD、CD对包埋结果有显著影响(p<0.05)。

2.2.3 响应面优化分析 等高线图可以直观地反映两变量交互作用的影响程度,圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形与之相反[23]。根据回归方程绘制响应面图见图6。

为考察各个因素交互对玫瑰茄花色苷微胶囊包埋率的影响,将两个影响因素固定在零水平,分析另外两个因素的交互作用对玫瑰茄花色苷微胶囊包埋率影响。由图6a～图6c可以看出,两两因素交互作用不显著,表现为等高线呈圆形且曲线稀疏,响应面的坡度走势平缓。由图6d可以看出,包埋率随着CaCl2质量分数和壁芯比的增加都是先增加后趋于平稳。CaCl2质量分数和壁芯比之间的交互作用对包埋率的影响较为显著(p<0.05),表现为等高线呈椭圆形且曲线较密集。同理,由图6e、6f可以看出,CaCl2质量分数和壳聚糖质量分数、壁芯比和壳聚糖质量分数之间存在较显著的交互作用,表现为等高线呈椭圆形且曲线较密集。

图6 各因素交互作用对微胶囊包埋率影响的等高线和响应面图Fig.6 Contour and response surface plots showing the interactions of various factors on microencapsulation efficiency

2.2.4 验证试验结果 利用Design-Expert 8.0.6软件得到了玫瑰茄花色苷最佳包埋工艺为海藻酸钠质量分数1.98%,CaCl2质量分数2.46%,壁芯比1.73∶1 g/g,壳聚糖质量分数0.13%,优化得到理论值为98.08%。为了可行性操作,调整参数为海藻酸钠质量分数2.0%,CaCl2质量分数2.0%,壁芯比2∶1 g/g,壳聚糖质量分数0.1%,此条件下进行3次平行实验,得到玫瑰茄花色苷实际包埋率为99.2%,标准差为0.16%,与预测值拟合性好,可进行后续的研究。

2.3 锐孔法制备微胶囊花色苷的形态观察

图7为最优条件下,利用锐孔法制备的微胶囊花色苷,平均颗粒直径为7 mm,形状呈球形,表面光滑,半数以上无拖尾现象,符合实际制备和使用要求。

图7 玫瑰茄花色苷微胶囊颗粒形态Fig.7 Morphology of anthocyanins microspheres from Hibiscus sabdariffa

2.4 花色苷微胶囊红外光谱测定结果

红外光谱主要是利用红外光对物质进行分析和鉴定的一种光谱学方法,它根据红外光谱特征峰的形状、强度及位置,可以判断微胶囊是否形成[24]。花色苷、微胶囊化三种壁材及微胶囊的红外光谱见图8。由图8可以看出,海藻酸钠在3435 cm-1处的特征吸收峰,是由O-H的伸缩振动引起的;在1598 cm-1处是C=O的特征吸收峰,由于羰基形成氢键使吸收峰发生蓝移引起的;在1416 cm-1处特征峰,由于羧酸盐引起的对称伸缩振动;在1030 cm-1处有一个宽的吸收峰,是由于C-O引起的伸缩振动。壳聚糖在3418 cm-1处有一个较宽的吸收峰,是由于N-H中不对称和对称伸缩振动引起的;在1633和1422 cm-1处特征峰的主要振动方式为-NH3+的对称和不对称的弯曲振动;在1159 cm-1处特征峰,是由于C-O引起的伸缩振动。花色苷样品的主要特征峰在3424、1619、1428;3424 cm-1处的特征峰是由于样品在冷冻干燥过程中残留的水分导致了O-H的伸缩振动;在1619和1410 cm-1处特征峰,是由于芳环骨架C=C键引起的伸缩振动。花色苷在1741～1069 cm-1处出现了特征吸收峰,而微胶囊的图谱中未出现,这是由于玫瑰茄花色苷的吸收峰大多被海藻酸钠和壳聚糖壁材所掩盖,由此可证明玫瑰茄花色苷的微胶囊已经形成。

图8 不同的壁材、花色苷和微胶囊的红外光谱图Fig.8 FTIR spectra of encapsulated anthocyanins powder, anthocyanins extractsand different wall materials

2.5 玫瑰茄花色苷微胶囊贮藏稳定性分析

2.5.1 温度对花色苷微胶囊稳定性的影响 由图9可见,花色苷和花色苷微胶囊在4 ℃条件下贮藏35 d,保留率较高,稳定性好;但在25和50 ℃条件下,花色苷微胶囊的保存率明显高于同温度下花色苷的保存率。这表明,低温下花色苷的存在形式不会影响花色苷的保存率;在常温或高温环境下,需要将花色苷制成微胶囊形式以提高花色苷的保存率,由此说明微胶囊化对花色苷具有一定的保护作用,提高其稳定性,易于贮藏。与Yamdech等[25]高温下有利于桑葚花色苷微胶囊的保存的研究结果一致。

图9 温度对花色苷微胶囊稳定性的影响Fig.9 Effect of temperature on the stability of anthocyanins microcapsules

2.5.2 光照对花色苷微胶囊稳定性的影响 由图10可见,随着贮藏时间的延长,在光照条件下,微胶囊化花色苷的保留率明显高于未微胶囊化花色苷,说明微胶囊化能有效提高花色苷稳定性。在避光条件下,两种状态的花色苷均有较高的保留率,说明避光有利于花色苷的贮藏。与微胶囊化玉米黄色素具有光保护作用,明显提高玉米黄色素的保存率的研究结果[26]一致。

图10 光照对花色苷微胶囊稳定性的影响Fig.10 Effects of light on the stability of anthocyanins microcapsules

2.6 花色苷体外缓释效果评价

玫瑰茄花色苷微胶囊在体外模拟人工胃、肠液的缓释效果,如图11所示。

图11 花色苷微胶囊的释放率Fig.11 Release rate of anthocyanins microspheres

由图11可见,玫瑰茄花色苷微胶囊在人工胃、肠液中的释放率随着时间的延长而增加;从折线趋势可看出,微胶囊在人工肠液比在人工胃液中的释放速率快。当30 min时,在胃液和肠液中释放率相差无几,均为8%左右,但随着时间的推移,肠液中的释放率增加迅速,在120 min时肠液中的释放率已达61%,超过总量的一半,但此时胃液中的释放率仅为17.4%,远远小于肠液中的释放量。这是因为壳聚糖分子中的氨基与海藻酸钠分子中的羟基的成膜作用受pH影响较大,在碱性条件下,壳聚糖分子中的氨基质子化程度降低,导致壁材变薄,机械强度降低,易发生溶胀,随着时间的延长,使芯材完全释放出来[16]。在210 min时,微胶囊中花色苷在肠液中能被完全释放。由花色苷的生物活性研究可知,花色苷可通过肠道细胞吸收进入血浆和组织,达到有效利用。这表明微胶囊花色苷能有效提高花色苷的利用率。

3 结论

本研究以壳聚糖、海藻酸钠为壁材,采用锐孔法制备玫瑰茄花色苷微胶囊,并利用响应面法优化得到玫瑰茄花色苷微胶囊制备的最佳工艺参数为海藻酸钠质量分数2.0%,CaCl2质量分数2.0%,壁芯比2∶1 g/g,壳聚糖质量分数0.1%,玫瑰茄花色苷包埋率为99.2%。玫瑰茄花色苷微胶囊平均颗粒直径为7 mm。由红外光谱分析可知,与花色苷比较,微胶囊花色苷在1741～1069 cm-1特征吸收峰发生变化,说明玫瑰茄花色苷微胶囊形成。在低温或常温条件下微胶囊化玫瑰茄花色苷具有较好的稳定性。在模拟体外人工胃、肠液缓释效果时,花色苷微胶囊在人体胃、肠液中都具有一定的缓释效果,能更好的保证花色苷在人体的吸收利用。