米根霉对脱脂米糠酚类物质释放的影响

张慧娟,曹欣然,柳天戈,王 静

(北京工商大学,北京市食品添加剂工程技术研究中心,中国-加拿大食品营养与健康联合实验室(北京),北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048)

米糠是稻谷加工后产生的一种副产品,是大米的皮层(外果皮、中果皮、种皮及糊粉层)、胚芽、碎米和淀粉的混合物,占谷粒重量的5%～8%[1]。米糠的营养成分随品种、精碾条件等因素的不同而有较大差异,与精白米相比,它含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、膳食纤维和矿物质,还含有不饱和脂肪酸、生育酚、生育三烯酚、谷维素、植酸等多种天然生物活性物质,这些活性成分具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、降胆固醇、杀菌、增强免疫力等功能,对人体的健康起着非常重要的作用[2],联合国工业发展组织称米糠为一种未充分利用的原料。

全世界米糠年产量约为7亿吨,我国米糠年产量超过1400万吨[3],居世界之首,是一种量大面广的可再生资源。而美国和日本是对米糠资源开发最早,技术最发达的国家。目前美国利普曼公司已经开发出米糠稳定化技术及相关产品,其公司生产的米糠营养素价格是原料米糠的20倍。由于国内稻谷加工企业比较分散,新鲜米糠稳定性差,易变质,米糠中粗纤维、油脂含量高,口感粗糙,适口性差,因此我国对米糠的利用程度较低,90%左右的米糠得不到充分利用[4]。

为提高米糠的营养特性,拓宽米糠的功能特性,丰富米糠的风味,可以通过发酵的方法对米糠进行改性。据报道,利用米根酶[5]固态发酵米糠,在发酵过程中酚类化合物含量增加,发酵后的米糠酚类提取物对过氧化物酶和自由基的氧化性有抑制的作用。Kupski等[6]研究发现,利用米根霉固态发酵米糠,可以提高米糠的抗氧化性,增加米糠蛋白质含量。与固态发酵相比,半固态发酵的不溶性固体基质中含有可被利用的碳水化合物,氮源和矿物质,并且具较高水分活度[7],可以避免固态发酵所带来的微生物种类选择少,发酵效率较低,周期长等缺点;与液态发酵相比,半固态发酵含水量较低,可以缩短样品干燥时间,节约能源。

本文以米根霉作为半固态发酵的菌种,在0～48 h,30 ℃条件下进行发酵,对米糠的营养特性以及理化性质进行探究,比较不同发酵时间下米糠的多酚及黄酮含量变化,持水性、持油性的变化,为米糠的合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠 新乡原阳大米有限公司;米酒发酵剂(米根霉) 安琪酵母股份有限公司;没食子酸 美国Sigma公司;橄榄醇 北京华威锐科化工有限公司;芦丁 上海源叶生物科技有限公司;正己烷、乙酸乙酯、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠、固蓝、三氯化铝、亚硝酸钠、丙酮、无水乙醇,甲醇 分析纯,国药集团;福林酚 北京半夏生物科技有限公司;DPPH、Trolox 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

FW-100高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;SX-700全自动高压灭菌锅 北京昭天伟业科技有限公司;SPX-250B-Z普通生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设厂;Free Zone R真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司;JA5003电子天平 上海精密科学仪器有限公司;CR22N高速离心机 日立;SHZ-82A恒温振荡器 常州国华电器有限公司;Synergy H1MDG多功能酶标仪 美国BioTek;旋转蒸发仪 BUCHI;C-MAG HS-7磁力搅拌机 IKA集团。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜的米糠用粉碎机磨细,过60目筛,得到粒径不超过0.3 mm的米糠粉粒。以v∶w=3∶1(体积与质量比)的比例加入正己烷,在25 ℃脱脂30 min[8],25 ℃室温风干后得到脱脂米糠,装于密封袋,-20 ℃贮藏备用。

1.2.2 米糠发酵 取100 g脱脂米糠,加入1∶1 (w∶v)的蒸馏水搅拌均匀,121 ℃灭菌20 min;冷却到30 ℃后加入0.4 g米根霉,并加入50 mL无菌水再次搅拌均匀。置于温度30 ℃,湿度50%的恒温恒湿发酵箱中培养48 h。共设置6组,以未灭菌的脱脂米糠作为对照,每隔12 h取出一组,100 ℃灭菌10 min,在-80 ℃冷冻干燥24 h后,用高速万能粉碎机粉碎60 s,置于-20 ℃储存备用。每组做三个平行。

1.2.3 游离酚酸的提取 按照Min等[9]的方法加以修改。取0.5 g发酵后米糠用10 mL丙酮∶水∶醋酸溶液(70∶29.5∶0.5,v∶v∶v)室温下磁力搅拌2 h,5000 r/min离心10 min,复提1次。收集上清液,50 ℃旋蒸,残留物用甲醇重新定容到10 mL。在-20 ℃储存待用。

1.2.4 结合酚酸的提取 按照Min等[9]的方法加以修改。提取完游离多酚后,残渣用2 mol/L的NaOH(1∶20,w∶v)室温下磁力搅拌,消化2 h,之后用6 mol/L的HCl调节pH至1。用50 mL乙酸乙酯提取5次,5000 r/min离心10 min后收集上清液,50 ℃旋蒸至提取液干燥,残留物用甲醇重新定容到10 mL。在-20 ℃储存待用。

1.2.5 多酚含量的测定 按照Zhao等[10]的方法加以修改。分别取100 μL结合酚酸和游离酚酸提取液,各加入100 μL蒸馏水至离心管中,加入1 mL福林酚试剂和0.8 mL 7.5%碳酸钠溶液混合均匀。混合物在避光条件下孵育1 h,测量765 nm处的吸光度。以没食子酸浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。根据没食子酸标准曲线(y=1.6853x-0.0023R2=0.9968。),样品中的多酚含量表示为没食子酸当量(GAE),单位为mg GAE/100 g DW(dry weight of fraction)。总酚含量为游离多酚含量和结合多酚含量之和。所有样品进行3次重复。

1.2.6 黄酮含量的测定 按照Ti等[11]的方法加以修改。分别取100 μL结合酚酸和游离酚酸提取液与1.5 mL的蒸馏水混合,加入90 μL 5%亚硝酸钠溶液反应6 min。然后加入180 μL的10%三氯化铝溶液,震荡均匀后孵育5 min。再加入0.6 mL 1 mol/L的NaOH溶液和330 μL的蒸馏水,震荡均匀后在510 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。根据芦丁标准曲线(y=0.6053x+0.0536R2=0.9978),样品中的黄酮含量表示为芦丁当量,单位为mg rutin/100 g DW。总黄酮含量为游离黄酮含量和结合黄酮含量之和。所有样品进行3次重复。

1.2.7 烷基间苯二酚(ARs)含量的测定 按照Rebolleda等[12]的方法加以修改。1 g脱脂米糠与10 mL乙酸乙酯混合,在室温下用磁力搅拌器搅拌2 h。5000 r/min离心10 min,50 ℃旋蒸干溶剂。用1 mL的甲醇导出残留物。取10 μL的萃取液,加入90 μL的无水甲醇,10 μL 5%碳酸钾溶液,100 μL的固蓝(0.05%的固蓝),避光加盖振板10 min,在25 ℃,480 nm下测定吸光度。以橄榄醇浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。根据橄榄醇标准曲线(y=0.0038x+0.1007R2=0.9934),样品中的ARs含量表示为橄榄醇当量,单位为mg olivetol/100 g DW。所有样品进行3次重复。

1.2.8 DPPH自由基清除能力测定 按照Cheng等[13]的方法加以修改。将结合酚酸和游离酚酸提取液稀释100倍,用甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH和Trolox标准曲线。实验在白色96-微孔板上进行。具体操作如下:样品组取100 μL的DPPH溶液与100 μL的样品溶液混合均匀,对照组取100 μL的DPPH溶液与100 μL的甲醇混合均匀,空白组取200 μL甲醇,在黑暗下孵育30 min,在517 nm处测量吸光值。以trolox浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。根据trolox标准曲线(y=0.8029x+10.113,R2=0.9999),样品中的DPPH自由基清除能力表示为trolox当量,单位为mg TE/100 g DW。DPPH自由基清除率之和(总抗氧化性)为游离酚酸抗氧化性和结合酚酸抗氧化性之和。所有样品进行3次重复。

1.2.9 功能性质测定

1.2.9.1 持水性测定 参照Raghavendra等[14]的方法稍作修改测定持水力(water holding capacity,WHC)。称量离心管重量,称取约1 g样品,加入30 mL水,60 ℃水浴磁力搅拌1 h后立即冷水浴,使温度降至常温。室温下,离心转速5000 r/min,离心30 min后立刻弃掉上清液,称重离心管。

式中:WHC:试样持水力大小,g/g;M0:离心管初始质量,g;M1:样品质量,g;M2:离心沉淀与离心管总质量,g。

1.2.9.2 持油性测定 参照Raghavendra等[14]的方法稍作修改测定持油力(oil holding capacity,OHC)。称重离心管重量,记录,称取约1 g样品,加入20 mL大豆油,在37 ℃水浴1 h。离心转速5000 r/min,离心30 min后立刻弃掉上清液,称重离心管。

式中OHC:试样持油力大小,g/g;W0:离心管初始质量,g;W1:样品质量,g;W2:离心沉淀与离心管总质量,g。

1.3 数据处理

实验结果采用Excel 2010和SPSS Statistics 22软件进行数据处理和分析,采用单因素方差分析法检验,显著性水平为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 脱脂米糠游离多酚、结合多酚、总酚含量测定结果

由图1可以看出,游离多酚和总酚含量随发酵时间增加呈现提高的趋势,结合多酚的含量变化并不规律,当米糠发酵12 h时,结合多酚的含量降低,在0～12 h内,米根霉处于生长阶段,会消耗米糠中的营养物质进行自身的繁殖。结合多酚含量在12～24 h呈现轻微上升的趋势,在24～48 h呈现下降的趋势。通过米根霉发酵,脱脂米糠中的结合多酚含量由未处理组的286.13 mg/100 g提高到发酵48 h组的412.43 mg/100 g,提高44.1%。通过发酵产生的酶可以作用于木质素,将结合态多酚释放为游离状态,发酵48 h的米糠游离多酚由未处理时的316.56 mg/100 g增加到478.35 mg/100 g,增加了51.11%。在发酵过程中,由于脱脂米糠的游离态多酚含量提高,总酚含量缓慢上升,在36 h处游离多酚和结合多酚含量总和达到最大,总酚含量增加到917.83 mg/100 g,与未处理组相比,总酚含量增加了47.3%。Ribeiro等[14]与本文有相似的研究,未脱脂米糠和脱脂米糠两种原料在米根霉CCT 7560作为发酵剂的固态发酵条件下,总酚含量呈现相同的上升趋势。Kupski等[6]在使用米根霉CCT 7560固态发酵米糠时,在0～36 h总酚含量逐渐上升,36～48 h总酚含量略有下降,与本研究结果相似。因此,米根霉发酵处理脱脂米糠与未处理的脱脂米糠相比,可以提高米糠的游离、结合、总多酚含量,且在发酵36 h后总酚含量达到最大值。

图1 米糠游离多酚、结合多酚、总酚含量Fig.1 Free,bound and total phenolic composition of rice bran注:同一指标小写字母不同表示差异显著(p<0.05);图2～图4同。

2.2 米糠游离黄酮、结合黄酮,总黄酮含量

图2为不同发酵时间对米糠中的游离黄酮,结合黄酮及总黄酮含量的影响。通过发酵,结合态黄酮含量随发酵时间增长呈现降低的趋势,游离态的黄酮和总黄酮含量随发酵时间的增长呈现上升的趋势。脱脂米糠经过米根霉发酵48 h后,游离黄酮由未处理组的442.43 mg/100 g,提高到673.89 mg/100 g,比未处理组提高了45.7%;结合黄酮由未处理组的229.12 mg/100 g提高到356.28 mg/100 g,发酵48 h组结合黄酮含量提高了55.5%;发酵48 h组总黄酮含量由未处理组的691.56 mg/100 g升高到1030.17 mg/100 g,总黄酮含量增加了48.96%。据Liu等[15]的报道,利用乳酸菌发酵可以使游离和结合黄酮含量均增加。除此之外,据王小平等[16]的研究,用米根霉进行生物改性后的麸皮添加到面包中,比普通白面面包多酚和黄酮含量高出1.76、1.61倍。因此可以看出,微生物不仅可以提高麸皮中的黄酮含量,对于米糠同样可以起到提高黄酮含量的作用,米根霉发酵处理可以有效释放脱脂米糠中的酚酸,显著提高米糠中的黄酮含量(p<0.05),提高米糠的利用价值。

图2 米糠游离黄酮、结合黄酮、总黄酮含量Fig.2 Free,bound and total flavonoid of rice bran

2.3 米糠发酵过程中ARs的含量

近年来,ARs被作为全谷物食品的生物标记物[17]。ARs作为全谷物中的营养因子,具有抗菌[18]、降低胆固醇吸收[19]、减轻全麦制品的苦味,保留风味[20]等作用。Katina等[21]研究发现,在发酵黑麦麸时,ARs的含量有一定程度的升高。经过高压灭菌的米糠在其发酵过程中,ARs含量随发酵时间呈现上升的趋势,由图3可以看出,从0 h开始ARs的含量逐渐增加,与图1所示的总酚含量的趋势相似;在发酵0 h的样品中,ARs的含量是14.31 mg/100 g,发酵48 h的含量增长到17.58 mg/100 g,含量显著提高(p<0.05)。

图3 脱脂米糠ARs含量Fig.3 ARs contents of defatted rice bran

2.4 DPPH自由基清除能力分析

近年来,全谷物食品中的酚类活性物质及其抗氧化性受到广泛研究。由表1可知,不同发酵时间的米糠酚酸提取物抗氧化性与多酚含量变化趋势相似。脱脂米糠发酵36 h时,游离态酚酸提取物的自由基清除能力最强,达到3.04 mg TE/100 g DW,与游离态多酚含量在发酵36 h达到最大相一致。脱脂米糠发酵48 h时,米糠结合态酚酸提取物的自由基清除能力最强,达到21.69 mg TE/100 g DW。发酵48 h脱脂米糠总酚提取物DPPH自由基清除能力最强,达到23.76 mg TE/100 g DW,与Kupski等[6]研究结果类似。

表1 不同发酵时间对米糠酚酸提取物的DPPH自由基清除能力的影响(mg TE/100 g DW)Table 1 Effect of different fermentation time on DPPH free radical scavenging ability of phenolic acid extract in rice bran(mg TE/100 g DW)

2.5 功能性质分析

持水性通常是指以大分子构成的机体结构通过物理方式截留水从而阻止水渗出的能力。微生物在发酵过程中,淀粉等糖类物质被菌体分解利用,转化为有机酸,如苹果酸、阿魏酸、乳酸等[22]。由图4可知,米糠持水性逐渐下降,当脱脂米糠发酵48 h时,持水性比发酵0 h时降低18.3%,原因可能是由于米糠中可溶性物质的析出导致的。而由图4可知米糠的持油性随发酵时间的增加逐渐上升,当脱脂米糠发酵48 h时,其持油性比发酵0 h组提高46.6%,其原因可能是随着发酵进行,米糠中的淀粉和蛋白质等物质被米根霉分解消化,纤维素和木质素被水解,可溶性膳食纤维增加,米糠的空间结构变得松散,比表面积增大,暴露了一些亲油基团,与油脂的接触面积增大,因此持油能力提高[23]。由Ahmad等[24]的研究可知,在用真菌(灵芝、茶树菇、杏鲍菇、金针菇及香菇)发酵米糠时,米糠的持水性和持油性在不同菌种发酵后发生改变,其中金针菇菌种发酵的米糠持水性减弱,持油性增强,与本研究结果相似。

图4 不同发酵时间米糠的持水性、持油性Fig.4 Water holding capacity and oil holding capacity of rice bran under different fermentation time

3 结论

不同发酵时间对米糠的多酚和黄酮含量及其体外抗氧化能力影响较大。脱脂米糠在发酵36 h时,总酚含量达到最大值,为917.83 mg/100 g,与未处理组相比总酚含量增加47.3%。总黄酮的含量在发酵48 h达到最大值,为1030.17 mg/100 g,与未处理组相比总黄酮含量增加48.96%。抗氧化能力在发酵48 h DPPH自由基清除能力最高。而米糠中的功能性成分ARs含量有轻微的提高。持油和持水能力发生改变,在0～48 h持水能力随发酵时间的增加逐渐降低,持油能力随发酵时间的增加逐渐增强。研究结果表明,利用米根霉发酵的米糠可以开发营养更丰富的功能性产品。发酵过程中相关酚酸变化需进一步研究,以便阐明发酵造成相关变化原因。