豌豆蛋白的添加对猪肉盐溶蛋白凝胶特性的影响

计红芳,李莎莎,张令文,王雪菲,陈复生,马汉军,*

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003;2.河南工业大学食品科学与工程博士后流动站,河南郑州 450001)

蛋白质是肉中的主要成分,约占肉重的18%～20%。肉制品生产的成功与否,主要取决于肉蛋白质的凝胶性、保水性、保脂性和乳化性等。在肉制品加工中,常采用添加外源性物质,例如添加淀粉、膳食纤维、胶体、非肉蛋白等作为增稠剂、赋形剂和填充剂来提高产品出品率、降低脂肪含量,改善产品品质[1]。栗俊广等[2]研究发现,木薯淀粉可以改善猪肉盐溶蛋白凝胶的质构和保水性;Choi等[3]研究表明,添加1%米糠纤维的猪肉盐溶蛋白凝胶的水分含量、溶解性和保水能力达到最高;Gao等[4]研究发现,0.7%的卡拉胶和5%的大豆分离蛋白混合添加可以明显提高猪肉盐溶蛋白凝胶的强度和保水性;张巍[5]研究表明,添加大豆分离蛋白可显著提高猪肉盐溶蛋白凝胶的硬度、弹性及保水能力。非肉蛋白和肉类盐溶蛋白的相互作用是通过非肉蛋白添充或改变共凝胶体系的内部构造,从而影响肉制品的品质。豌豆蛋白对猪盐溶蛋白凝胶品质的影响相关研究较少,是否有与大豆分离蛋白改善凝胶品质相似的功效,有待进一步研究。

豌豆蛋白占豌豆组成的23%～25%,必需氨基酸比例协调,基本可称为全价蛋白,符合FAO/WHO的推荐标准,兼具调节肠胃、降低血压及动脉粥样硬化、肿瘤等发病风险。豌豆蛋白具有良好的溶解性、起泡性、乳化性和胶凝性等,是一种优质的植物蛋白资源[6-7]。近年来,豌豆蛋白的应用价值逐渐被挖掘,相关研究主要集中在豌豆蛋白的提取制备[8-9]、功能特性及改性[7,10]和酶解制备活性产物[11],以及在肉乳制品、水产品、面制品、焙烤制品等领域的应用[12-13]。然而在肉制品领域中的应用研究较少,豌豆蛋白添加到香肠中,可改善香肠的热稳定性、颜色、质构和感官品质等[14-16]。本文研究了豌豆蛋白对猪肉盐溶蛋白凝胶特性的影响,为豌豆蛋白在肉制品中的应用提供理论依据,以期提高豌豆蛋白的综合利用价值,旨在使豌豆蛋白在食品生产过程中得到普遍的应用与推广。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪背最长肌(日龄约180 d的三元杂交猪) 新乡世纪华联超市;豌豆蛋白(蛋白含量80%) 烟台东方蛋白科技有限公司；氯化钠、氢氧化钠、戊二醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇、氯仿等 均为国产分析纯。

DZKW-4型电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;UMC-5C斩拌机 德国Stephan公司;TA-XT plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司;绞肉机 山东嘉信食品机械有限公司;BP221S型电子天平 德国Sartorius公司;WFG7200型可见分光光度计 上海优尼柯仪器有限公司;T25型高速分散器 德国IKA公司;CR-400色差仪 日本Konica Minolta公司;Quanta 200扫描电子显微镜 美国FEI公司;PQ001台式NMR分析仪 上海纽迈电子有限公司;Haake Mars 60旋转流变仪、台式高速冷冻离心机 德国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 猪肉盐溶蛋白提取及凝胶的制备 盐溶性蛋白的提取参考Sun等[17]和栗俊广等[18]的方法,并进行适当修改。将新鲜猪背最长肌剔除脂肪和结缔组织,切块,用绞肉机绞成肉糜,加入4倍质量的提取液(0.6 mol/L NaCl),混匀均质,调pH7.0,4 ℃放置24 h,10 000 r/min离心10 min,上清液即盐溶蛋白。

将豌豆蛋白0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 g(质量体积比分别为0、2%、4%、6%、8%,10%,g/mL),加入到30 mL 50 mg/mL盐溶蛋白溶液中,充分混匀,均质,4 ℃冰箱静置12 h,25～85 ℃水浴,85 ℃保持5 min,冷却至室温,4 ℃冰箱,放置12 h,制备凝胶。

1.2.2 色泽的测定 采用CR-400色差仪,以标准白板作为对照,对样品进行测定。每组随机取三块平行样品,每块样品在固定的某一表面随机选取三个点测定,记录L*、a*和b*值,分别为亮度指数、红度指数和黄度指数[19]。

1.2.3 蒸煮得率的测定 参考Zhu等[20]的方法并稍作改动。将混合蛋白样品装入50 mL离心管,称重,即为蒸煮前的重量。将此样品在25～85 ℃水浴,85 ℃保持5 min,煮制后冷却至室温,在4 ℃条件下放置12 h,室温下环境回温2 h,用滤纸吸干表面水分,称量并记录重量,即为蒸煮后重量。

蒸煮得率(%)=蒸煮后的重量/蒸煮前的重量×100

1.2.4 保水性的测定 参考王希希等[21]的方法并稍作改动。将制备好的凝胶称重,记为M1,置于离心管中,4 ℃、5000×g离心15 min,滤纸吸干表面水分,再次称量,记为M2,离心后凝胶重量占原重的百分比,即为保水性(water holding capacity,WHC)。

WHC(%)=M2/M1×100

1.2.5 质构的测定 参考Zhou等[22]的方法并稍作修改。对凝胶样品(Φ2 cm×2 cm)进行质构测试,探头类型为P/36R,参数:测试前速2 mm/s,测试速度2 mm/s,测试后速2 mm/s,压缩样品高度为40%,时间5 s,触发类型为自动,触发力5 g。测定指标为硬度、咀嚼性、弹性和恢复性。每组样品测定6次求平均值。

1.2.6 流变特性的测定 参考Kang等[23]的方法并稍作修改。用50 mm不锈钢圆形平板探头,间隙为0.6 mm,将样品均匀涂抹在2个平板间,外周涂一层薄的硅油,以防止水分蒸发。在25 ℃保温10 min,然后从25～85 ℃升温,加热速率为2 ℃/min。在加热过程中,在一个固定的频率为0.1 Hz和一个振荡模式下对样品进行连续剪切,记录储能模量G′的变化。每个处理测定3次。

1.2.7 微观结构的测定 将凝胶样品切成2 mm的小条,用2.5%的戊二醛(pH6.8)浸泡24 h。先用0.1 mol/L pH6.8的磷酸缓冲液洗3次,每次为15 min,再用50%～90%的乙醇脱水,每次为15 min,无水乙醇脱水3次,每次10 min。采用氯仿进行脱脂1 h,无水乙醇∶叔丁醇=1∶1 (v/v),以及叔丁醇各进行一次置换,每次为15 min。真空干燥后进行扫描观察[24]。

1.2.8 NMR自旋-自旋驰豫时间(T2)的测定 参考邵俊花等[25]的方法并稍做修改。质子共振频率为22 MHz,测量温度为32 ℃。将大约2 g样品放入直径为15 mm的核磁管中,并将其放入仪器。自旋-自旋弛豫时间T2用CPMG序列进行测量。使用参数为:η～值(90°脉冲和180°脉冲之间的时间)为200 μs,重复扫描32次,重复间隔时间为110 ms,得到12000个回波。每组样品测定6次求平均值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶色泽的影响

色泽是评价凝胶外观的一个较为重要的指标。由图1可知,凝胶的L*、a*值均随豌豆蛋白添加量的增加而下降,L*值在添加量为10%时为77.12,与对照相比下降3.01%;添加量为8%和10%时a*值差异不显著(p>0.05),二者与对照相比下降显著(p<0.05);b*值随豌豆蛋白添加量的增加而升高,未添加豌豆蛋白时,凝胶b*值为-3.16,添加量为10%时,达到7.83。有文献表明,肌红蛋白在加热过程中结构伸展变性,转化为褐色的高铁肌红蛋白等复杂产物,致使红度下降[26],这可能是豌豆蛋白-猪盐溶蛋白共混凝胶a*值下降的原因之一。另外,豌豆蛋白呈淡黄色,其添加量越大,共混凝胶的颜色就越黄越暗。雷跃磊等[27]研究发现,添加大豆蛋白可使鱼肉猪肉复合凝胶的L*值下降,b*值上升,与本试验结果一致。

图1 豌豆蛋白添加量对凝胶色度的影响Fig.1 Effects of pea protein addition on the color of gel注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05),图2同。

2.2 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶保水性和蒸煮得率的影响

由图2可知,随豌豆蛋白添加量的增加,凝胶的保水性和蒸煮得率均呈上升趋势。添加量为4%时保水性为86.84%、蒸煮得率为88.31%,与对照相比分别上升了5.4%和3.7%(p<0.05)。添加量为4%的保水性,与6%～10%相比,差异不显著(p>0.05);添加量为4%的蒸煮得率,与6%、8%相比,差异不显著(p>0.05),但与10%相比,差异显著(p<0.05)。有研究表明,在凝胶形成过程中,蛋白质相互聚集、相互交联形成有序三维网状结构,豌豆蛋白填充于网络结构间隙,可以束缚水分子的运动,更好的把水分截留在网络体系中,减少水分流失[28]。因此,随豌豆蛋白添加量的增加,保水性升高,蒸煮得率也随之上升。

图2 豌豆蛋白添加量对凝胶保水性和蒸煮得率的影响Fig.2 Effects of pea protein addition on the water holding capacity and cooking yield of gel

2.3 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶质构的影响

由表1可知,随豌豆蛋白添加量的增加,凝胶的硬度、咀嚼性均呈上升趋势。硬度、咀嚼性在豌豆蛋白添加量为10%时最大,分别为988、688 g,是对照的2.57和2.74倍;凝胶的弹性与回复性随豌豆蛋白添加量的增加,均呈先升高后下降的趋势,但都显著高于对照组(p<0.05),在添加量为4%时达到最大值,分别为0.961、0.405,与对照相比增加了2.67%和12.19%。

表1 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶质构的影响Table 1 Effects of pea protein addition on texture of pork salt-soluble protein gel

在加热形成共混凝胶的过程中,豌豆蛋白良好的乳化性、胶凝性和保水性,会得以更好体现。豌豆蛋白的添加,可对凝胶网络结构进行机械充填与包埋,硬度、咀嚼性、弹性与恢复性等均增加,但豌豆蛋白过量添加,超过4%以后,由于其自身吸水性较强,阻碍了猪肉盐溶蛋白和水之间的相互作用[29],使体系游离的水变少,凝胶变得又韧又硬,硬度和咀嚼性升高,弹性与恢复性则下降。吴振等[30]研究发现,在大豆分离蛋白与鸡肉盐溶蛋白共混凝胶形成过程中,由于大豆分离蛋白自身凝胶结构的形成,促进了与盐溶蛋白的相互作用,增强了共混凝胶的质构特性。刁新平等[31]研究了大豆蛋白对牛肉凝胶特性的影响,结果表明,随大豆蛋白添加量的增加,凝胶弹性大体呈先增加后下降趋势,到3%后,弹性显著降低。大豆蛋白添加量的增加,会造成固形物的增加,可能与牛肉蛋白竞争可利用的水分,从而对蛋白相产生浓缩效应,降低了凝胶的弹性,与本文研究结果一致。

2.4 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶流变特性的影响

凝胶的形成主要经历两个过程,首先蛋白质受热变性展开,然后展开的蛋白质因为凝集作用而形成较大分子的凝胶体。储能模量G′既反映了不同温度下蛋白分子展开和凝集的过程[32-33],也反映了蛋白凝胶的弹性和凝胶性的强弱[34]。由图3可知,在整个加热过程中,盐溶蛋白凝胶的储能模量出现3个阶段的变化。在26～41 ℃区间,储能模量G′基本保持不变,随着温度从42 ℃增加到56 ℃,G′逐渐上升,并且在56 ℃达到第一个峰值,这是凝胶网络形成的初始阶段,此时肌球蛋白头部通过二聚体作用开始交联,形成弹性或蛋白质网络结构[35];继续加热,G′值下降,并在62 ℃左右达到最小值,这是由于肌球蛋白分子尾部发生变性,导致蛋白分子发生重组,破坏了先前形成的蛋白网络结构;随后在63～80 ℃,G′值快速上升,此时盐溶性蛋白由粘性溶胶转变成一个黏弹性好的凝胶网状结构[36]。共混凝胶G′的初始值和终值均高于对照,且随豌豆蛋白添加量的增加而升高,总体变化趋势与盐溶蛋白相似,与硬度结果一致,表明豌豆蛋白能够提高猪肉盐溶蛋白形成凝胶的能力,可以显著改善凝胶的质构特性。李可等[37]研究发现,随竹笋膳食纤维添加量的增加,猪肉盐溶蛋白凝胶的G′值明显增加;Gao等[4]研究表明,大豆分离蛋白能提高猪肉盐溶蛋白的胶凝能力;Chang等[38]研究发现,豆渣可以使猪肉肉糜凝胶的G′值显著增加,添加量越大,G′值越高,均与本文的研究结果一致。

图3 豌豆蛋白添加量对盐溶蛋白凝胶储能模量的影响Fig.3 Effects of pea protein addition on storage modulus of pork salt-soluble protein gel

2.5 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白凝胶微观结构的影响

由图4可知,未添加豌豆蛋白的凝胶网络结构较为粗糙松散,并且出现较多的孔洞。添加豌豆蛋白后,豌豆蛋白对网络结构有支撑作用,填补了蛋白网络结构间的空隙。添加量为4%时,空洞基本消失,形成了高度致密、均一、有序的三维网络结构。添加量大于4%时,多余的豌豆蛋白颗粒散落在凝胶体系,不能进行有效的填充和包埋,添加量越高,散落的豌豆蛋白颗粒越多,凝胶结构越粗糙。可见,适量的豌豆蛋白可以有效填充凝胶网络结构,与本实验中保水性、质构的结果一致。与松散粗糙的凝胶结构相比,均匀致密的凝胶体系具有较高的持水能力,小孔可以更牢固地锁住水分[39]。Gao等[4]研究表明,大豆分离蛋白与猪肉盐溶蛋白间的化学作用力包括二硫键与疏水相互作用。冯婷等[29]研究发现,添加2.5%的花生浓缩蛋白可以使鸡肉盐溶蛋白凝胶的三维网络结构更加紧密、有序,蛋白质交联度更高。Sun等[32]研究认为,花生蛋白可与鸡肉盐溶蛋白发生交联,使盐溶蛋白凝胶孔洞变小,改善凝胶网络结构。

图4 豌豆蛋白添加量对凝胶微观结构的影响Fig.4 Effects of pea protein addition on the microstructure of gel

2.6 豌豆蛋白添加量对猪盐溶蛋白共混凝胶水分迁移的影响

豌豆蛋白对猪盐溶蛋白凝胶体系中水分分布和迁移的影响,可通过质子NMR测量自旋-自旋弛豫时间(T2)来反映。T2弛豫时间越短,表明水与底物结合越紧密,T2越长,表明水分越松散[40]。结合水弛豫时间在0～10 ms之间,表征凝胶网络结构内部的水,用T2b表示;T21和 T22弛豫时间分别在10～100 ms和250～400 ms之间,分别表示不易流动水和游离水,即凝胶网络结构间的水分和自由水[41]。由表2与图5可知,本实验出现3个特征峰,即T2b、T21和T22。随豌豆蛋白添加量的增加,T2b、T21、T22均呈现出峰值向较短时间方向移动的趋势,添加量为10%时,T2b、T21、T22均降至最低。峰面积代表此部分水所占百分比,随豌豆蛋白添加量的增加,P2b虽然也在增加,但最高也只有1%左右,表明结合水在凝胶体系中所占百分比极小,不是凝胶中水分主要存在形态。P21持续增加,P22持续下降,添加量为4%与10%的P21差异不显著(p>0.05),在87.43%～90.95%之间,表明不易流动水是凝胶中水分主要存在形态,且添加量为4%的豌豆蛋白就能够将更多的自由水束缚在凝胶结构中,限制了水分的移动,充分降低了凝胶的水分损失,提高了凝胶的保水能力。栗俊广等[2]研究表明,木薯淀粉添加量为1.5%时,可以显著增加猪肉盐溶蛋白凝胶不易流动水的比例,降低自由水的比例,提高了共混凝胶的保水性。

表2 豌豆蛋白对猪盐溶蛋白共混凝胶水分迁移的影响Table 2 Effects of pea protein on the water migration of pork salt-soluble protein blend gel

图5 豌豆蛋白添加量对凝胶弛豫时间T2及峰面积的影响Fig.5 Effect of pea protein addition on the transverse relaxation times(T2)and peak area of gel

3 结论

豌豆蛋白可以有效改善猪肉盐溶蛋白的凝胶品质,提高共混凝胶的形成能力。添加豌豆蛋白,可以提高共混凝胶不易流动水的比例,降低自由水的比例,提高了凝胶保水性与蒸煮得率,改善了凝胶的质构;豌豆蛋白添加量为4%时,凝胶网络结构均匀致密,高度有序。将豌豆蛋白添加到猪肉盐溶蛋白形成共混凝胶,不仅可以增加凝胶类产品的营养价值与保健功能,还可以对豌豆蛋白进行深度的利用与挖掘,可为豌豆蛋白在肉制品中的应用提供理论支撑。豌豆蛋白来源广泛,价格低廉,在肉制品行业应用前景十分广阔。然而,在豌豆蛋白与猪肉盐溶蛋白形成共混凝胶过程中,猪肉盐溶蛋白构象变化规律及豌豆蛋白-猪肉盐溶蛋白凝胶网络结构形成中最主要相互化学作用力,还不完全清楚,将是今后重点的研究方向。