细胞外基质对背根神经节细胞生长分化的影响

戴宛平 潘瑶 康倩若 任雪敏 阳小飞 刘孟雪

关键词 细胞分化 背根神经节细胞 底物成分 多聚赖氨酸

中图分类号：R338.1                                  文献标识码：A   DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2019.10.039

Abstract Dorsal root ganglion cells （DRG） are important cells in the peripheral nervous system to sense and transmit pain. Polylysine is a common extracellular matrix （ECM） for nerve cells cultured in vitro. However， the specific effects of different types and concentrations of polylysine on the growth and differentiation of dorsal root ganglion cells have not yet been clarified. Objective： To investigate the effects of polylysine of different types， concentration and molecular weight on the growth and differentiation of rat dorsal root ganglion cells. Methods： The effects of D-type and L-type polylysine on the differentiation rate and average process length of rat dorsal root ganglion cells were studied from three aspects： time gradient， concentration gradient and molecular weight. Results： The results showed that L-polylysine could promote the length of cell processes at 48 hours in normal working concentration. When the concentration of D-polylysine and L-polylysine decreased to 5 ug/ml and 20 ug/ml respectively， the cells differentiated better on L-polylysine-coated slide， while the normal molecular weight （3-7W） or high molecular weight （>3 ug/ml） were better. 0 W） D-polylysine had no significant effect on the growth and differentiation of dorsal root ganglion cells.

Keywords cell differentiation; dorsal root ganglia; substrate composition; Polylysine

0 前言

背根神經节（Dorsal Root Ganglion， DRG）神经细胞是外周神经系统中感受、传导痛觉的重要细胞。[1]背根神经节神经细胞在周围神经系统有重要的作用，在神经保护、神经损伤后的修复及神经轴突体外延长培养和热痛等伤害性刺激对离子通道的影响等生物学实验以及相关的药理学研究中扮演着重要的角色。[2]

神经细胞生长分化是神经系统发育过程中的重要步骤，需要细胞内多种蛋白及细胞外基质共同作用来调控。有研究报道，细胞外基质成分是影响背根神经节细胞生长分化的因素之一。多聚赖氨酸是神经细胞体外培养常用的ECM。[3]常用的多聚赖氨酸有L型（L-PL）和D型（D-PL）两种，由于其亲水性质易于细胞贴壁生长，常用于细胞培养。但不同类型、不同浓度以及不同分子量（相对分子质量）的多聚赖氨酸对背根神经节细胞生长分化的具体影响目前仍不清楚。本项目计划通过改变多聚赖氨酸类型（L型与D型）、浓度、分子量，统计细胞的分化率和平均突起长度，来观察ECM对背根神经节细胞生长分化的影响，为研究ECM调控神经细胞生长分化的机制提供依据。

1材料与方法

1.1 实验材料

80g SD雄鼠。

1.2 方法

1.2.1 背根神经节细胞的分离与培养

取出老鼠脊柱，并沿脊椎剖成两半，从脊髓侧面取出背根神经节（DRG）。剔净DRG周围的组织并充分剪碎至糊状。将剪碎后的DRG放入2ml消化酶中消化30min，每隔5min拿出来轻轻吹打。取出一滴消化液，放置显微镜下观察，若看到消化成单个浑圆的细胞，则停止消化，否则继续消化。消化结束加入3mL培养基，1000 g离心3min。弃上清，加适量培养基，重悬。滴片，将细胞放入CO2培养箱中培养2 h使其贴壁，待细胞贴壁后加入培养基培养。

1.2.2 固定及细胞成像

固定：吸出培养基，每孔加入400 l 4%的PFA溶液，室温下固定15 min，贴片。

细胞成像：贴片后，每类样本在激光共聚焦显微镜放大60倍下分别随机选取6-10个视野，进行成像处理。

2结果

2.1 常用工作浓度L、D型多聚赖氨酸对DRG生长分化的影响

本次实验通过统计比较DRG细胞的分化率，平均突起长度，观察D型和L型多聚赖氨酸对细胞生长分化的影响。常用工作浓度为100 g/ml的L-PL及25 g/ml的D-PL，用这些ECM包被玻片，超纯水水洗晾干后培养细胞。当某个细胞的突起总长度大于这个细胞胞体直径的2倍时，我们一般认为此细胞属于已分化细胞。分别对培养12 h、24 h、48 h、72 h的DRG 细胞统计分析分化率和突起长度，结果如图1所示。

从图1 （A）可知，在12-72 h的分化率没有显著差异，说明在72 h 内，L和D型多 聚赖氨酸对DRG细胞的分化率的影响无显著差异，而从图1 （B）可知，培养至48 h时DRG的平均突起长度有明显差异（进行t检验可得P值小于0.01）。因此，我们可以认为，L型多聚赖氨酸在细胞成长48 h时对细胞的突起长度有一定的促进作用。

2.2 不同浓度梯度L、D型多聚赖氨酸对DRG生长分化的影响

从第一阶段实验结果可知，以100 g/ml L-PL和25 g/ml D-PL作為细胞外基质时，培养至48h的DRG细胞平均突起长度差异显著，但其对分化率的影响无显著差异。那么影响DRG细胞分化率的因素是什么，升高或降低ECM浓度，是否会对其分化率造成影响？

因此我们设计不同浓度梯度的多聚赖氨酸包被的玻片培养DRG细胞，统计细胞生长 48h时细胞的分化率，即L型多聚赖氨酸浓度为L-20 g/ml，L-100 g/ml，L-500 g/ml，D型多聚赖氨酸的浓度为D-5 g/ml，D-25 g/ml，D-125 g/ml，培养至48 h，计算其分化率。此时浓度梯度的对照关系为：D-5 g/ml & L-20 g/ml，D-25 g/ml & L-100 g/ml，D-125 g/ml & L-500 g/ml。统计结果如图2所示。

2.3 不同分子量D型多聚赖氨酸对DRG生长分化的影响

制备工艺不同，会产生不同相对分子质量的多聚赖氨酸，分别使用相对分子质量为3-7 W和>30 W（高分子）的工作浓度下D-PL包被玻片，计算其分化率与平均突起长度，结果如图3所示。

3讨论

背根神经节细胞是周围神经系统主要的传入初级神经元，在不同刺激对膜离子通道的影响等生理学研究中起重要作用，[1]由于DRG细胞具有在体外生存能力强的特点，且从大鼠中取材较为方便，因此在本课题中，选用80 g SD雄鼠作为实验材料。[2]

有研究表明，细胞外基质成分是影响背根神经节细胞生长分化的因素之一，[4]为提高神经细胞的分化率与存活率，需选择合适的细胞外基质。目前常用多聚赖氨酸作为培养细胞时的细胞外基质。[5]

经本课题研究发现，ECM为25 g/ml D-PL和100 g/ml L-PL时，DRG细胞在12-72 h的分化率没有显著差异，培养至48 h时DRG的平均突起长度有明显差异，被L-PL包被的玻片上DRG平均分支长度较长，因此，我们认为在细胞成长48 h时L-PL会促进细胞的生长;改变两种多聚赖氨酸浓度后，L-PL和D-PL培养至48 h时的细胞分化率仅在5 g/ml的D-PL和20 g/ml的L-PL的一组对照下存在显著差异，具体表现为被L-PL包被的玻片上DRG细胞分化率较高，而在25 g/ml D-PL和100 g/ml L-PL及125 g/ml D-PL和500 g/ml L-PL两组对照下无明显差异，我们初步猜测低浓度的L-PL更有利于DRG细胞的生长分化;改用不同分子量的25 g/ml D-PL培养，发现ECM为高分子量与普通分子量的D型多聚赖氨酸时，DRG的突起数与分化率不存在显著性差异，说明常用浓度下D型多聚赖氨酸的分子量对DRG的生长分化无显著影响。查阅相关文献可知，[3，6，7，8]多聚赖氨酸的相对分子质量可能会影响到神经元的聚集现象，但对其影响机制还需进一步的研究。

*通讯作者：阳小飞  刘孟雪

本研究由国家自然科学基金项目（31670850）;中南民族大学科学基金引进人才科研启动基金自科项目（ZZ13002）资助

参考文献

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[4] Kazunori Sango， Hidenori Horie， Shuji Inoue. Administration of an aldose reductase inhibitor， ONO-2235， to streptozotocin-diabetic mice restores reductions of DRG neuronal attachment to extracellular matrix proteins in vitro[J]. Neuroscience Letters，1999.263（2）.

[5] 许汉鹏，苟琳，杨浩，王春婷，鞠躬. 神经干细胞克隆在不同细胞外基质上的生长特性[J]. 解剖学杂志，2004（03）：249-252，306.

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[8] 张辉，刘林，薛文.退变和健康椎间盘组织提取细胞外基质诱导背根神经节轴突生长的差异[J].中国组织工程研究，2014.18（07）：1039-1044.