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刺托竹荪菌盖碳量子点的制备及其抑菌性研究

2019-09-10郑梅霞林丽萍刘波陈峥朱育菁

福建农业学报 2019年4期
关键词:竹荪

郑梅霞 林丽萍 刘波 陈峥 朱育菁

摘 要:【目的】利用废旧生物质资源制备量子点并增加细菌病害防治的资源。【方法】以刺托竹荪菌盖采用水热法合成碳量子点,并用透射电镜扫描、红外光谱、XRD和荧光分析对碳量子点进行表征。选取青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum和地毯草黄单胞菌Xanthomonas axonopodis作为供试菌种,采用抑菌圈法对碳量子点的抑菌性能进行研究。【结果】该方法制得的碳量子点近似球形,粒径均匀,分散性好。其发射波长依赖于激发波长,在紫外灯的照射下,出现明亮的蓝色荧光。碳量子点对青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌均有明显的抑菌作用。【结论】获得了一种可用于防治植物细菌病害的量子点。

关键词:碳量子点;水热;抑菌;竹荪

中图分类号:TS 201文献标识码:A文章编号:1008-0384(2019)04-438-05

Abstract: 【Objective】 Utilization of mushroom biomass waste to prepare carbon dots (CDs) for the prevention and control of diseases on plants was studied. 【Method】 CDs were obtained by hydrothermal oxidation of pilei of Dictyophora echinovolvata and characterized by the transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectrophoto-metry (FT-IR), x-ray diffraction (XRD), and fluorescene spectrophotometry. Antibacterial properties of the CDs were determined by measurements of diameter of the bacteriostatic circle on Ralstonia solanacearum and Xanthomonas axonopodis. 【Result】 The CDs obtained displayed an appropriate spherical morphology and uniform size with good dispersion. They emitted bright blue photoluminescence under UV excitation, exhibited an excitation-dependent PL behavior, and demonstrated excellent antibacterial activities against R. solanacearum and X. axonopodis. 【Conclusion】 The CDs with a potential of preventing and controlling plant diseases by bacterial infection were successful prepared in laboratory.

Key words: Carbon dots; hydrothermal method; antibacterial activity; Dictyophora echinovolvata

0 引言

【研究意义】碳量子点(Carbon dots, CDs)由碳元素构成,作为荧光性能优异的纳米材料(<10 nm),具有良好的荧光性能、良好的生物相容性、低生物毒性等优点[1]。其制备方法有很多种,通常可分为自上而下法和自下而上法,自上而下法是将碳骨架彻底粉碎而生成CDs的方法,包括弧光放电法、电化学法和激光销蚀法等;自下而上法是以一些有机分子作为前驱体碳源来合成CDs,包括模板法、微波消解合成法、超声振荡法、溶剂热法、强酸氧化法以及水热法等,其中水热法合成过程比较简单、经济且绿色环保[2]。生物质材料作为可再生无污染资源,作为制备碳量子点的碳源具有较大的优势。刘辰等[3]利用玉米秸秆制备酒精的残余物酶解木质素制备碳量子点;陈文新等[4]利用甘蔗渣为原料制备碳量子点。竹荪可分成可食部分(菌柄和菌裙)和不可食部分(菌蓋和菌托)。商品竹荪只是采收、加工可食部分,而占子实体鲜重60%以上的菌盖和菌托被直接遗弃,造成巨大的资源浪费[5]。如能选用竹荪的副产物竹荪菌盖制备量子点,则可增大资源利用率。【前人研究进展】碳量子点具有抑菌效果,Dou等[6]利用葡萄糖和聚乙烯亚胺制备的多功能碳量子点可以抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌;李红霞等[7]制备的槲皮素复合物碳量子点对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也具有明显的抑制作用;Liu等[8]利用甲硝唑合成的碳量子点可以抑制牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌。【本研究切入点】迄今尚未见碳量子点用于抑制植物病害致病菌的研究。作物的细菌性病害是一类世界范围的严重危害农业的病害[9]。青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum会引起番茄[10]、茄子[11]、花生[12]、烟草[13]等44个科的数百种植物发生青枯病[14];地毯草黄单胞菌Xanthomonas axonopodis会引起柑橘溃疡病[15]、木薯枯萎病[16]和棉豆的白叶枯病[17]等,细菌病害给作物生产带来巨大经济损失。尽管对它们的防治有很多研究报道,如筛选生防菌、栽培措施、作物轮作及品种抗性选择等,但未出现有效的防治措施[18]。【拟解决的关键问题】本研究利用刺托竹荪生产的副产物竹荪菌盖为前躯体,采用水热法制备碳量子点,选取青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌为植物细菌性病害病原菌种,采用抑菌圈法对制得的量子点进行抑菌实验。为丰富细菌病害防治的资源奠定基础,并为废旧生物质资源利用提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棘托竹荪Dictyophora echinovolvata菌球由福建省顺昌县食用菌办提供。竹荪菌球洗净后放置试验台上,待其完全开伞后收集竹荪菌盖,清洗掉菌盖上的孢体,室温下晾干,4℃保存备用。

1.2 供试菌株与培养基

青枯雷尔氏菌FJAT-91、地毯草黄单胞菌FJAT-10151,-80℃甘油冷冻保存,现保藏在福建省农业科学院农业生物资源研究所。

培养基:NA液体培养基(牛肉膏3 g·L-1,蛋白胨5 g·L-1,葡萄糖10 g·L-1);NA固体培养基在液体培养基基础上加入18 g·L-1琼脂,半固体培养基则加入9 g·L-1琼脂。

1.3 碳量子点的制备

称取1 g的竹荪菌盖,用15 mL超纯水分散均匀,将样品装入25 mL的聚氟乙烯反应釜中,180℃水热反应8 h,自然冷却,用0.22 μm的尼龙过滤头过滤,用1 000 Da透析20 h,每隔8 h换一次水。透析袋内溶液即为碳量子点CDs溶液。

1.4 抑菌试验

病原菌发酵液的获得:-80℃冰箱取菌株FJAT-91、FJAT-10151冻存管,待其回温到室温,于超净台内划线于NA固体培养基上,倒置于生物培养箱30℃培养2 d后,挑取单菌落进行第二次划线培养,保证活化菌落形态单一。挑取第二次活化后的单菌落于各含100 mL NA液体培养基的250 mL锥形瓶中,于30℃、170 r·min-1摇床中培养培养2 d,采用紫外分光光度计检测病原菌发酵液在600 nm的吸光度值,备用。

分别取1 mL病原菌FJAT-91(OD600 = 1.928)和FJAT-10151(OD600 = 1.152)的发酵液与200 mL 50℃的NA半固体培养基混合后,倒入已制备好的NA固体培养基中,制成含病原菌的双层培养基;待培养基凝固后,用直径9 mm的打孔器在平板上打孔,在孔内分别加入200 μL碳量子点样品CDs,以水为对照,30℃恒温培养2 d,观察抑菌效果。

1.5 结构表征

1.5.1 透射电镜扫描

采用HITACHI HT7700对碳量子点的形貌进行分析,用3%戊二醛固定样品后,用磷酸盐缓冲液洗涤3次后制作铜网底片,再用1%的磷钨酸染色,干燥后采用透射电子显微镜观察,电压为80 kV。

1.5.2 红外光谱分析

采用德国布鲁克公司傅立叶红外光谱仪,利用溴化钾压片法对所制备的量子点在波长范围500~4 000 cm-1范围内进行测试。

1.6 荧光分光光度分析

采用Horiba公司的Fluoromax-4 荧光光谱仪进行荧光测定,狭缝为2 nm。

2 结果与分析

2.1 碳量子点的表征

2.1.1 透射电镜扫描分析

碳量子点CDs的透射电镜图如图1所示,碳量子点CDs的粒度分布窄,单分散性好,平均直径为2 nm,为非结晶性物质。

2.1.2 红外光谱分析

碳量子点的红外光谱分析如图2所示。3 439 cm-1处的吸收峰为-OH伸缩振动,3 205 cm-1处的吸收峰为-NH2伸缩振动,1 648 cm-1为C=O的伸缩振动,1 397、1 121、1 048 cm-1处的吸收峰为C-O-C伸缩振动,说明碳量子点表面富含大量的羧基和羟基,表明碳量子点具有很强的亲水性。这些基团对CDs-C的改性和应用起到重要的作用,大量的羧基和羟基使其具有极强的溶解性,冻干后极易吸潮。

2.1.3 荧光分析

图3-A左图是碳量子点在365 nm紫外灯照射下的蓝色荧光,可以看出,碳量子点具有荧光性。其最大激发/发射波长分别为396 nm/470 nm,在396 nm光的激发下可发射出470 nm的荧光(图3-B);其发射具有明显的波长依赖性(图3-C),CDs随着激发波长的增大,其荧光发射峰从440 nm红移至505 nm,发射峰强度先增大后减小。

2.2 碳量子点对植物病原菌的抑制效果

竹荪菌盖制备的碳量子点CDs对植物病原菌青枯雷尔氏菌FJAT-91和地毯草黄单胞菌FJAT-10151均具有抑制效果,如图4所示。抑菌圈直径如表1所示,其对菌株FJAT-91的抑菌圈直徑大小为(25.21±1.73)mm,对菌株FJAT-10151的抑菌圈直径大小为(22.41±1.05)mm。

3 讨论与结论

本研究以刺托竹荪菌盖为碳源,采用一种工艺简单、制备成本低、绿色环保的水热法制备了平均直径为2 nm的荧光碳量子点,并借助红外光谱法、透射电镜和荧光光谱法等表征手段研究碳量子点的结构,同时,该碳量子点对青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌具有较好的抑制作用,为细菌病害防治奠定基础。

竹荪菌盖含有氨基酸[19]、蛋白质[20]、多糖(葡萄糖、甘露糖和半乳糖等)[21]和挥发油(芳香烃、醇、脂肪酸、酮、倍半萜、酯、醛等)[22]等,是一种制备量子点的资源,本研究利用竹荪菌盖制备获得了碳量子点。

防治青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌的主要措施有化学农药防治[23]、杀菌剂[24]、芽胞杆菌[25]和轮作[26]等,但是防治效果不理想。本研究制备的量子点能有效抑制青枯雷尔氏菌和地毯草黄单胞菌,是一种新的防治资源。

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(责任编辑:林海清)

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