花楸花粉超低温保存及再生

于琦 杨雨荷 刘欢 郑昕雨 孔繁秋 张海莹 宋红

摘 要：【目的】探讨花楸（Sorbus pohuashanensis）花粉超低温保存及再生的方法，以延长其花粉保存时间，为科研、生产提供理论和实践依据。【方法】分别设置不同培养基配方、不同光照、不同采集时间处理，进行花楸花粉离体萌发试验，测定各试验处理的花粉萌发率;设置不同冷冻方式和化冻方式处理，测定两种方式不同处理的花粉萌发率;制备不同含水率的花粉，分别测定其在超低温保存前、后的萌发率。【结果】（1）培养基为100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸的处理，花粉萌发率最高，达72.42%;（2）黑暗处理花粉萌发率为77.24%，比光照处理高8.96个百分点;（3）一天中，10∶00和14∶00采集的花粉，其活力显著高于其他时间采集的花粉;（4）-20℃预冷冻培养30 min后投入液氮保存24 h的处理效果最好，花粉萌发率达43.15%;（5）超低温保存后40℃水浴解冻5 min处理比其他解冻方式处理的花粉活力高，萌发率为35.70%;（6）花楸花粉超低温保存最适含水率为7.72%，此含水率下花粉超低温保存后萌发率最高，为31.53%。【结论】花楸花粉采用超低温技术保存24 h后仍具有活力，黑暗条件、花粉采集时间、花粉萌发培养基、花粉含水率、冷冻与化冻方式均会对花楸花粉超低温保存效果产生显著影响。

关键词：花楸;花粉;超低温保存;种质资源保护

中图分类号：S 686文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）04-409-07

Abstract： 【Objective】Cryopreservation and regeneration of pollens of Sorbus pohuashanensis were investigatied. 【Method】 An in vitro method was developed with experiments on medium formulation， light exposure， and pollen collection for the pollen germination rate determination.The germination rates of  S.pohuashanensis pollens treated by various freezing and thawing procedures  and different moisture contents before and after the treatments were compared. 【Result】（1） The medium for optimum pollen germination was found to consist of  sucrose 100 g·L-1 and  boric acid 100 mg·L-1 that delivered a rate of 72.42%. （2） Incubation in darkness yielded a germination rate of 77.24%， which was 8.96 percentage point higher than that under light exposure. （3） The vitality of pollens collected at 10 a.m. or 2 p.m. was significantly higher than other time in a day. （4） Among all cryopreservation methods tested， pre-freezing pollens at -20℃ for 30 min prior to submerging in liquid nitrogen for 24 h provided the greatest germination rate of 43.15% after thawing. （5） For thawing， soaking the frozen pollens in a 40℃ water bath for 5 min rendered the highest germination rate of 35.70%. （6） Moisture content of the pollens for the cryopreservation was determined to be 7.72% to result in the best germination rate of 31.53% after thawing. 【Conclusion】The cryopreservation conditions for S. pohuashanensis pollens as established would result in high viability and germination rate after storage.

Key words： Sorbus pohuashanensis; pollen; cryopreservation; germplasm preservation

0 引言

【研究意义】植物种质资源超低温保存技术是指在液氮（-196℃）的超低温条件下将植物的器官进行保存，如此低温条件下，植物材料中与细胞生长代谢有关的各种生物酶的活性受到极大抑制，生物体新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”状态，从而可以延长植物材料保存时间，理论上实现植物种质资源的永久保存[1]。对于具有良好观赏价值、食用价值和药用价值的花楸来说，研究探讨其花粉的超低温保存及再生的最佳方式方法具有重要意义。花粉是育种的重要材料和植物种质的重要形式，采用超低温保存方法可以延长花粉保持生活力的时间，从而克服花期不遇、地理分隔等困难，为杂交育种，单倍体育种奠定基础，促进新品种培育;同时，实现花粉超低温保存可为其种质资源的保存和交换提供更经济便捷的方式。【前人研究进展】国外较早开展花粉超低温保存的研究，1922年Knowlton最早报道了金鱼草花粉经-180℃贮存后仍有活力[2]。20世纪80年代，花粉超低温保存在我国日渐兴起。目前，花粉超低温保存技术已广泛应用于农作物和园林植物等，如牡丹、丁香、山茶和桃叶卫矛[3-6]等园林植物均已成功进行了花粉的超低温保存。【本研究切入点】鉴于超低温保存花粉的效果因植物材料的不同有很大的差异，而有关花楸花粉超低温保存方面的研究未见报道，本研究从影响花粉超低温保存效果的主要因素入手，以花粉萌发培养基、花粉日活力最高时间，以及进行超低温保存的花粉最佳含水率、预冷冻方式与化冻方式为切入点，进行上述各主要影响因素的单因素试验。【拟解决的关键问题】明确花楸花粉萌发的最佳培养基，光照对花粉萌发的影响，花粉日活力最高的时间，以及进行花粉超低温保存的最佳预冷冻方式、化冻方式与花粉最佳含水率，提出花楸花粉超低溫保存的最佳方式方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

花楸花粉采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校园内，于2018年5月花楸花期内选择晴朗的天气，直接采集花朵，置于硫酸纸袋内带回实验室，在实验室内抖落花药上的花粉，完成对花粉的收集。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉生活力测定方法

花粉培养采用悬滴萌发法[7]。将花粉放入25℃人工气候培养箱内培养3 h后取出，于电子显微镜下观察，统计花粉萌发率。花粉管长度超过花粉直径2倍记为花粉萌发。视野内花粉萌发率=视野内花粉萌发数/视野内花粉总数。每次随机选取5个视野，视野内花粉萌发率的平均值为该次测定花粉的萌发率。

1.2.2 花粉萌发最适培养基筛选试验

进行不同质量浓度的蔗糖与硼酸二因素交叉试验。试验设蔗糖质量浓度梯度为50、100、150、200 g·L-1，硼酸質量浓度梯度为100、150、200 mg·L-1，组合为12个培养基配方处理，3次重复，即每个处理观测3个载玻片，每个载玻片随机选取5个视野统计花粉萌发率。

1.2.3 光照对花粉萌发力的影响试验

设置黑暗和光照两个处理。以在盛有培养基的培养皿外面包裹锡纸为黑暗处理，不包锡纸为光照处理。均放入25℃人工气候培养箱中培养3 h。每组重复3个试验，观察及统计花粉萌发率同1.2.2。

1.2.4 花粉日活力的测定

选择晴朗天气，一天内分别于8∶00、10∶00、12∶00、14∶00、16∶00采集花粉，测定不同采集时间的花粉萌发率。

1.2.5 花粉预冷冻处理试验

将新鲜花粉装入1.8 mL冷冻管中，设置5个处理，即：不经预冷冻（CK）;-4℃恒温预冷冻30 min;-20℃恒温预冷冻30 min;-80℃恒温预冷冻30 min;逐级变温预冷冻（-4℃、30 min→-20℃、30 min→-80℃、30 min），然后均立即投入液氮里储存24 h。

此时间设置的依据是：花粉超低温保存24 h后，时间长短对花粉活力无显著影响[4，8-9]。化冻后分别测定其花粉萌发率。

1.2.6 花粉化冻方式试验

新鲜花粉从上述液氮中保存24 h后取出，分别用自来水化冻5 min，40℃水浴化冻2 min，25℃室温下化冻30 min，测定3种化冻方式的花粉萌发率。

1.2.7 不同含水率花粉的超低温保存试验

采用烘干法测定花粉初始含水量M0[10]。

采用硅胶干燥法制备不同含水率的花粉。称量新鲜花粉的质量（Ma），装入1.8 mL干燥管后称量总质量（Mb），将盛有新鲜花粉的干燥管放入硅胶干燥器中干燥一段时间后称量质量记为Mc。

利用上述方法将新鲜花粉分别干燥2.5、5.0、7.5 h，得到含水率分别为9.94%、7.72%、4.84%的花粉。分别测定不同含水率花粉投入液氮冷冻前的萌发率和投入液氮保存24 h后的萌发率。

2 结果与分析

2.1 培养基对花粉萌发力的影响

由图1可知，花粉萌发率在不同培养基处理间差异达显著水平（P<0.05）。当硼酸质量浓度固定在100 mg·L-1时，花粉萌发率随着蔗糖质量浓度的增加，呈现先显著增加后显著减小的趋势，最高值出现在蔗糖质量浓度为100 g·L-1时，其萌发率达72.42%;当硼酸质量浓度固定在150 mg·L-1时，花粉萌发率随蔗糖质量浓度的增加，也是呈现先显著增加后显著减小的趋势，最高值出现在蔗糖质量浓度150 g·L-1时，其萌发率达53.65%;当硼酸质量浓度固定在200 mg·L-1时，花粉萌发率随蔗糖质量浓度增加而显著下降，最高值出现在蔗糖质量浓度50 g·L-1时，其萌发率为36.96%。当蔗糖质量浓度固定在50 g·L-1时，硼酸质量浓度的改变对花粉萌发率没有显著影响，其萌发率在36.95%～42.63%;其他3个蔗糖质量浓度处理（100、150、200 g·L-1），均表现为随着硼酸质量浓度的改变，花粉萌发率都显著改变，但变化趋势并不相同。可见，在双因素试验中，其中一个因素质量浓度的改变，其花粉萌发率并未表现出相同的变化趋势，说明一个因子对花粉萌发是发挥促进作用或抑制作用是由另一个因子决定的，培养基中的蔗糖和硼酸存在最佳质量浓度配比的问题，本试验中花粉萌发率最高的处理组合是蔗糖100 g·L-1、硼酸100 mg·L-1处理，其花粉萌发率可达72.42%。

对花楸花粉在不同蔗糖和硼酸质量浓度培养基上的萌发率进行方差分析发现，花粉的萌发率在蔗糖质量浓度间、硼酸质量浓度间、硼酸质量浓度×蔗糖质量浓度间均具有显著性差异。在硼酸质量浓度相同时，蔗糖质量浓度200 g·L-1的培养基花粉萌发率最低;在蔗糖质量浓度相同时，硼酸质量浓度200 mg·L-1的培养基花粉萌发率最低。可见，硼酸或蔗糖的质量浓度过高都会抑制花楸花粉的萌发。

2.2 光照对花粉萌发力的影响

由图2可知，采集的花粉置于100 g·L-1蔗糖+100 mg·L-1硼酸培养基中培养，在光照和黑暗两种不同培养条件下花粉萌发率差异达显著水平。光照处理的花粉萌发率为68.28%，黑暗处理的花粉萌发率为77.24%。说明黑暗条件更有利于花楸花粉的萌发。

2.3 花粉日活力变化

由图3可知，同一天内不同时间花楸花粉的萌发率不同。在10∶00和14∶00花粉萌发率达到一天中的两个高峰，分别为66.70%和65.81%，12∶00花粉萌发率大幅下降，在14∶00达到一天中最高后急剧下降，在16∶00达到一天中最低的萌发率。经过方差分析，10∶00与14∶00花粉萌发率差异不显著，但二者与一天中其他时间花粉萌发率的差异均达显著水平（P<0.05）。观测结果表明，花楸花粉在一天中活力最强的时间为10∶00和14∶00，此时采集的花粉萌发率最高。

2.4 预冷冻方式对花粉超低温保存效果的影响

由图4可知，不同预冷冻处理对花楸花粉超低温保存效果的影响有显著差异。以-20℃预冷冻30 min的花粉萌发率最高，达43.15%，与其他预冷冻方式比较差异显著（P<0.05）。经-80℃预冷冻30 min和不经预冷冻直接投入液氮的花粉萌发率差异不显著;-4℃预冷冻30 min处理的花粉萌发率最低，为15.04%，显著低于其他处理。试验结果表明，花楸花粉经-20℃预冷冻30 min的超低温保存效果最好。

2.5 化冻方式对花粉萌发率的影响

由图5可知，不同化冻方式处理间的花粉萌发率差异均达显著水平（P<0.05）。以40℃水浴化冻2 min处理的萌发率最高，为35.70%，均显著高于自来水化冻5 min和25℃室温化冻30 min两个处理。试验结果表明，花粉超低溫保存后40℃水浴化冻2 min效果最好，可作为下一步试验的依据。

2.6 不同含水率花粉超低温保存前后的萌发率

由图6可知，不同含水率的花楸花粉超低温保存前后萌发率有所差异。冷冻前，含水率为12.63%、9.94%、7.72%的花粉萌发率差异不显著，均高于25%，说明含水率在7.72%～12.63%时，含水率对冷冻前花粉的萌发率影响不大;但当含水率降到4.86%时，无一花粉萌发。冷冻后，含水率较低的两个处理（4.84%、7.72%）差异不显著;当含水率超过7.72%后，花粉萌发率会出现显著下降趋势。本试验结果表明，花楸花粉含水率为7.72%为最适宜花粉萌发的含水率。

含水率为9.94%和12.63%的花粉在冷冻后萌发率均有所下降，且冻前冻后花粉萌发率差异显著;而含水率为4.84%和7.72%的花粉在冷冻后萌发率均有所升高，其中含水率4.84%的花粉冻前冻后萌发率差异显著，含水率7.72%的花粉冻前冻后萌发率差异不显著。说明适宜的含水率不会造成花粉冷冻后萌发率的显著改变。

3 讨 论

蔗糖和硼酸对花粉管的萌发和伸长具有重要作用。蔗糖作为花粉萌发的能源物质，不仅起到提供能量的作用，还具有维持细胞渗透压的作用[11]。硼酸可以与糖类物质结合，促进花粉管对糖类物质的利用[12]。适宜的蔗糖和硼酸配比对花粉萌发有显著影响。本试验中不同蔗糖和硼酸配比处理的花粉萌发率差异显著，在蔗糖100 g·L-1+硼酸100 mg·L-1培养基培养下的花粉萌发率最高，显著高于其他处理。Brewbaker等[13]认为，硼酸是花粉萌发和花粉管伸长的重要影响因子，对大多数物种来说最佳质量浓度为100 mg·L-1，本试验结果与之一致。在蔗糖质量浓度为50～150 g·L-1时，均以硼酸质量浓度200 mg·L-1的培养基花粉萌发率最低;在硼酸质量浓度50～200 mg·L-1时，均以蔗糖质量浓度200 g·L-1的培养基花粉萌发率最低。究其原因，可能与培养基中蔗糖或硼酸质量浓度过高，使花粉细胞失水，抑制了花粉的萌发有关。前人的研究表明，花粉萌发与蔗糖、硼酸、钙、生物调节物质及pH值等因素有关，在复杂配方的培养基中蔗糖、硼酸的配比还有待于进一步的探究。

不同光照条件对不同植物花粉萌发率的影响不同。马尾松在黑暗条件下的花粉萌发率高于光照条件，但未达到显著差异水平[14];蒿柳在黑暗条件下的花粉萌发率显著低于光照条件 [15];光照和黑暗对柳树和桂花花粉萌发无显著影响[16-17]。而本试验与以上结果均不同。本试验结果显示，在黑暗条件下花楸花粉萌发率高于光照条件，且差异达显著水平（P<0.05）。花粉的离体萌发是模拟花粉在花中的萌发环境，本试验结果可能与花粉萌发时花楸花的状态有关，具体原因有待进一步探究。

花粉在一天中不同时间的活力不同，而不同植物花粉日活力变化趋势也不同。桂花花粉萌发率从8∶00到16∶00逐渐升高[18];甘蔗花粉一天中随着时间推移花粉萌发率逐渐降低，13∶00时花粉完全丧失活力[19];亚洲百合和万寿菊一天中花粉活力的变化为先升高后降低[20-21]。本试验中花楸花粉日活力的变化与上述植物的表现均不相同，花楸花粉活力在上午和下午分别呈现先上升后下降的趋势，分别在10∶00和14∶00达到两个峰值。一天中随着时间的变化，温度和光照强度也随之变化。一定的温度和光照强度可以促进花粉的发育和成熟，10∶00和14∶00的光照强度和温度可能最适宜花楸花粉的萌发，其花粉萌发率高;而12∶00的光照强度和温度均过高，其花粉萌发率较其他时间段低。

花粉超低温保存过程中预冷冻可以使细胞内的自由水发生保护性脱水，进行体外结冰，减少细胞内的冰晶，从而减少细胞受到冰晶机械损伤，同时预冷冻可以使细胞进行抗寒锻炼，提高耐寒性。预冷冻因植物材质的不同所产生的效果也不同。在对百合花粉的研究中发现，经过-20℃预冷冻的花粉萌发率显著高于室温、0℃、-70℃的处理 [22];对甘蓝型油菜的研究显示，逐步降温预冷冻处理对花粉形态和大小影响最小[9];马铃薯经过逐级降温预冷冻处理，花粉活力在超低温保存后有所提高[23]。本试验中，对新鲜花粉分别设置5种预冷冻处理，-80℃预冷冻处理和不经预冷冻处理的花粉超低温保存后花粉萌发率相差甚微，说明对于花楸花粉，-80℃下的预冷冻没有效果。逐级变温预冷冻处理的花粉超低温保存后花粉萌发率均显著高于-4℃预冷冻处理、-80℃预冷冻处理和不经预冷冻处理，但其花粉萌发率低于-20℃预冷冻处理的花粉，这表明花楸花粉在-20℃冷冻30 min的预冷冻方式最佳。这可能是由于花楸花粉在-20℃时，细胞膜的透性处于最适状态，有利于细胞发生保护性脱水，因而受到冰晶机械损伤程度最小，而-4℃和-80℃预冷冻处理因温度过低或过高，均不利于细胞发生保护性脱水。预冷冻对花粉超低温保存后的效果与含水率有较大关系，花楸花粉含水率与预冷冻的效果的关系有待于进一步探究。

解冻过程中有发生次生结冰，对细胞产生机械损伤，以及细胞吸水对细胞产生冲击的风险。因此，选择适宜的解冻方式对花粉超低温保存后恢复活力十分重要。目前采用较多的解冻方式有自来水化冻、室温解冻、水浴解冻。本试验设置40℃水浴化冻2 min、自来水化冻5 min和25℃室温化冻30 min等3个处理，结果显示40℃水浴化冻（2 min）效果最好，这与前人对百合[22]和山茶[5]的研究结果相一致。

大量研究结果显示，花粉含水率是花粉超低温保存成败的关键。含水率会影响花粉预冷冻和解冻方式的选择，当含水率过高时，花粉更容易产生冰晶，对细胞产生机械损伤;当含水率过低时，花粉无法满足其基本生理需求。本试验中花楸花粉含水率在4.84%时，花粉冷冻前的萌发率为零，这与花粉生理性缺水会影响其生理活性有关，但经过超低温保存后，其花粉萌发率显著升高，这种现象在山茶某些品种中也有出现[4]，其原因目前尚不清楚。花粉含水率为9.94%和12.63%（为初始含水率）时花粉超低温保存前后，花粉萌发率均有所下降，这可能与花粉相对含水率较高产生冰晶有关。花粉超低温保存后，含水率为7.72%的花粉萌发率最高，且冷冻前后的萌发率无显著差异。因此，建议花楸花粉经干燥5 h（含水率为7.72%）后进行超低温保存，但是在实际生产中，考虑到经济快捷的原则，也可不进行干燥，对初始含水率的花楸花粉直接进行超低温保存。

本试验分别探究了花粉超低温保存不同技术环节下的最佳处理，对于不同处理组合间综合作用关系及完整的花楸花粉超低温保存体系的建立还有待于进一步探究。

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（责任编辑：杨小萍）