三七总皂苷通过影响VEGF的表达改善多柔比星肾病大鼠蛋白尿
2019-09-10帅林杨颂余磊
帅林 杨颂 余磊
摘要：目的探讨三七总皂苷对多柔比星小鼠肾的保护作用及可能的机制。 方法将 24 只 8 周龄雄性 SD 大鼠随机分为 3 组：正常对照组，模型对照组和治疗组。模型对照组和治疗组予多柔比星建模，治疗组腹腔注射血栓通，连续 4 周，每周检测大鼠尿白蛋白 / 尿肌酐比值，4 周后检测 24h 尿微量白蛋白及各组大鼠肾组织中 VEFG 蛋白的表达情况。 结果 注射多柔比星 1 周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值開始升高，3 周和 4 周时，与模型对照组相比，治疗组的比值较模型对照组低， 差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组相比，治疗组的 24h 尿微量白蛋白低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比，模型对照组和治疗组的血管内皮生长因子（VFGF）蛋白表达降低，与模型对照组相比，治疗组的 VEGF 蛋白表达较高。 结论三七总皂苷具有改善化疗药物多柔比星引起的肾损害，其作用机制可能与增加 VEGF 蛋白的表达有关。
关键词：三七总皂苷;蛋白尿;血管内皮生长因子（VFGF）
【中图分类号】R322.6 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）05-017-02
大量蛋白尿是肾病综合征（NS）最主要的表现，也是肾脏疾病最常见的临床表现之一。多柔比星肾病是实验性肾损伤的经典模型，其主要表现类似于人类的微小病变型肾病，故国内外学者均用此模型模拟研究肾损伤 [1]。
三七总皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是从多年生草本植物中药三七中提取的有效成分，毒副作用小， 应用于很多疾病，具有活血、补血、溶血及抗溶血、抗炎、降脂、降血糖、抗衰老及抗氧化等作用 [2]。有研究表明三七总皂苷能提高血浆白蛋白，增加尿量，改善患者血液高凝状态[3]，并能抑制血小板活化[4]，从而减少微量蛋白尿，且未发现明显副作用 [5]。
多柔比星是临床常用的化疗药物之一，本研究通过建立多柔比星肾病模型，观察三七总皂苷对化疗后肾性蛋白尿的影响，观察尿白蛋白 / 尿肌酐比值，并从三七总皂苷对 VEGF 蛋白表达的影响，探讨三七总皂苷改善化疗后肾组织损伤的机制。
实验用动物为SPF级雄性SD（Sprague-Dawley） 大鼠24只，体质量 200-250g。血栓通粉针 （ 主要成分为三七总皂苷，PNS） ，丽珠集团利民制药厂生产，批号：Z44020284。多柔比星， 辉瑞制药有限公司， 批号： H20100406。
2.1 分组与给药 8 周龄雄性 SD 大鼠 24 只，适应性喂养1 周，随机分为 3 组，每组 8 只，分别为：正常对照组， 模型对照组和治疗组。模型对照组和治疗组大鼠尾静脉一次性注射多柔比星5.5mg/kg，继续饲养1周。1周后开始药物干预，治疗组腹腔注射血栓通粉针7.5mg/kg·d （ 相当于成人用量 ），对照组予腹腔灌注等量5%葡萄糖水，连续4周。
2.2 标本采集与检测 分别于每周用代谢笼收集清晨随机一次尿液，离心（3500r/min，15min），取上清液，置 -80℃ 冰箱保存备用，待测尿微量白蛋白、尿肌酐，采用全自动生化分析仪检测。4 周末，留取 24h 尿液，离心取上清， 采用全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白。4 周末，取肾脏皮质组织标本，提取总蛋白，待测肾组织 VEGF 的水平， 采用免疫蛋白印迹法检测。
蛋白质印迹法检测 采用含蛋白酶抑制剂的组织裂解液[1g/L 十二烷基磺酸钠（SDS）、10g/L脱氧胆酸钠（Sodium Deoxycholate） 、 10mL/L Triton X-100 、 150mmol/L 氯化钠（NaCl）、10mmol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA）、25mmol/L Tris HCl（pH 7.2）、1mmol/L 苯甲基磺酰氟 （PMSF）、1 mg/L 抑
肽 酶 （aprotinin） 、 1mg/L 亮 抑 肽 酶 （leupeptin） 、 1mg/L 胃蛋白酶抑制剂 （pepstatin）] 于超声粉碎仪冰上裂解肾组织 ，
13000r/min 低温离心 15min 取上清即为总蛋白 ; 每孔 75g 总蛋白进行 80g/L 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）， 湿转法转移至硝酸纤维素膜 ;50g/L 脱脂奶室温封闭1h; 分别加封闭液稀释的小鼠抗人 VEGF1-140 氨基端的单克隆抗体 C1 和小鼠抗兔 GAPDH 单克隆抗体于 4℃过夜 ; 然后加辣根过氧化物酶 （HRP） 标记的羊抗鼠 IgG 室温反应1h; 电化学发光法 （ECL） 发光试剂反应 1min; 曝光。
统计学处理 采用 SPSS16.0 软件进行数据分析，采用重复测量的方差分析，组间比较采用两两比较的 t 检验， 组间差异分析采用 One-way ANOVA 分析。P < 0.05 为差异有统计学意义。
三七总皂苷对各组大鼠尿白蛋白 / 尿肌酐的影响注射多柔比星 1 周后，大鼠尿白蛋白 / 尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，4 周时达到实验观察的最高值，与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。1 周和 2 周时，模型对照组和治疗组的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值无明显统计学差异，3 周和 4 周时，与模型对照组相比，治疗组的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值更低，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表 1 和图 1。
3.2 三七总皂苷对各组大鼠蛋白尿的影响 给与 SD 大鼠
分別处理 4 周后，留取 24h 尿液进行尿微量白蛋白的检测， 结果发现，与对照组相比，模型对照组和治疗组的 24h 尿微量白蛋白明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）， 与模型对照组相比，治疗组的 24h 尿微量白蛋白更低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 2。
3.3 三七总皂苷对各组大鼠肾组织中 VEFG 蛋白表达的影响 在各组大鼠的肾组织中检测 VEGF 蛋白，结果发现， 与对照组相比，模型对照组和治疗组的 VEGF 蛋白表达明显降低，与模型对照组相比，治疗组的VEGF 蛋白表达较高。见图 3。
三七总皂苷是中草药三七的主要生理活性成分，目前临床广泛应用的血栓通制剂的主要成分，具有抗缺氧、衰老、耐缺氧以及提高人体免疫力等作用，在人体各个系统及物质代谢方面都具有明显优势。最近的研究显示，黄芪联合三七能有效减轻糖尿病大鼠的尿蛋白，减轻足细胞的损伤， 主要机制是减轻足细胞足突融合，改善足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin 表达，保护肾脏[6]。本研究拟用经典的多柔比星肾病大鼠作为实验对象，探讨化疗后腹腔灌注三七总皂苷对肾脏的保护作用。结果显示，注射多柔比星 1 周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，
4 周时达到实验观察的最高值，差异有统计学意义。1 周和2 周时，模型对照组和治疗组的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值无明显统计学差异，3 周和 4 周时，与模型对照组相比，治疗组的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值更低，差异有统计学意义。且能够减少蛋白尿，表明三七总皂苷具有一定的改善肾功能的作用，减少蛋白尿的发生。
VEGF 是由多肽链通过二硫键连接构成的同源二聚体糖蛋白，属于血小板衍生生长因子家族，也是内皮细胞特异性丝裂原 [7] 。在心、肾、肺等脏器组织都有表达 [8]，在肾小球足细胞、远端肾小管和集合管处高表达，主要作用是维持肾小球滤过障的完整性和足细胞活性 [9]。VEGF 受体主要表达于肾小球内皮细胞、间质细胞以及管旁毛细血管，VEGF 及受体结合后，能够促进内皮细胞增殖和迁移、抑制内皮细胞凋亡、提高毛细血管通透性、改变细胞外基质、促进血管增生以及维持血管功能等作用[10]。蛋白尿和抑制 VEGF 的表达成正相关关系，抑制 VEGF 通路，能够降低足细胞裂孔隔膜蛋白 nephrin 的表达，增加足细胞足突融合 ， 甚至导致肾病综合征和 / 或肾小球血栓性微血管病变等肾脏疾病的发生 [10]。本研究在各组大鼠的肾组织中检测 VEGF 蛋白，结果发现，与对照组相比，模型对照组和治疗组的 VEGF 蛋白表达明显降低，与模型对照组相比， 治疗组的 VEGF 蛋白表达升高，提示化疗药物可以通过抑制 VEGF 通路导致大鼠肾脏功能受损，三七总皂苷可通过增加 VEGF 的表达保护肾脏功能。
本研究结果分析，多柔比星能够通过抑制 VEGF 通路导致大鼠蛋白尿的发生，损伤大鼠肾功能。三七总皂苷可以逆转多柔比星对 VEGF 通路的抑制，增加 VEGF 蛋白的表达，从而使肾血管舒张，改善肾脏微循环，减轻肾小球损害，这可能是三七总皂苷减少尿蛋白形成，保护肾功能的机制之一，为血栓通应用与临床化疗后保护患者的肾功能提供了理论依据。但具体的调节机制有待进一步研究。
[1] Li J S， Chen X， Peng L， et al. Angiopoietin-Like-4， a Potential Target of Tacrolimus， Predicts Earlier Podocyte Injury in Minimal Change Disease[J]. Plos One， 2015， 10（9）： e0137049.
[8] 张彬 ， 保莉 ， 张霞 ， et al. 糖尿病肾病患者血清
VEGF 与微量白蛋白尿的相关性研究 [J]. 宁夏医学杂志 ， 2016， 38（3）： 196-198.
[基金项目]2019 年度泰州市人民医院院级科研基金（ZL201917）
[作者简介]帅林（1986-），男，汉族，江苏泰州人，医师
[通信作者]余磊E-mail：guying500@163.com
