蓝莓叶片诱导愈伤组织最适培养基的研究

2019-09-10陶兴魁高贵珍张兴桃

赤峰学院学报·自然科学版 2019年6期

陶兴魁高贵珍张兴桃

摘要：目的：为了筛选蓝莓叶片诱导愈伤组织的最适培养基，借助蓝莓试管苗无性繁殖的优点使其快速繁殖.方法：利用蓝莓叶片作为外植体诱导愈伤组织的生成，选择不同种类的基础培养基及不同浓度组合的植物生长调节剂设计正交实验以找出最适宜蓝莓叶片诱导愈伤组织的培养基.结果和结论：WPM1/2基本培养基诱导愈伤组织效果最好，NAA对蓝莓叶片诱导愈伤组织影响最大，蓝莓叶片诱导愈伤组织的最适培养基为WPM1/2+0.5mg·L-1 ZT+1.0mg·L-1 IAA+0.15mg·L-1 NAA.

关键词：蓝莓叶片;愈伤组织;正交试验;培养基

中图分类号：S663.9 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2019）06-0032-04

蓝莓（blueberry）又被称为越橘或蓝浆果，蓝莓是“浆果之王”，它的果皮相对较薄，有着自己独特的风味以及丰富的营养成分，味道酸甜[1].蓝莓的果实中存在较多的营养组分，被国际粮农组织列为五大健康食品之一[2-3].蓝莓被誉为“黄金浆果”在我国具有很好的市场发展前景[4-5].蓝莓常规繁殖速度较慢，且病毒感染严重，品种容易退化[6-7]，利用组织培养则繁殖速度较快，且能保持品种特性[8].国内外对于蓝莓组培研究，多集中对蓝莓茎段或芽、茎尖等外植体诱导植株再生的研究[9-12]，但是较少的研究涉及以蓝莓叶片为外植体诱导愈伤组织的研究.在本实验中，采用蓝莓的叶片作为外植体，在试验中采用单因素实验对MS培养基、改良MS培养基、WPM培养基、WPM1/2培养基、1/2WPM培养基进行筛选.然后利用ZT、NAA、IA三种激素之间的不同浓度组合来设计正交试验，研究蓝莓叶片诱导的愈伤组织的最适培养条件.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

苗圃园蓝莓幼嫩叶片.

1.1.2 试剂材料

IAA、NAA、ZT、琼脂、蔗糖、消毒剂等.

1.1.3 实验场所及仪器

组培室、无菌操作台、紫外灯、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶（500ml）、量筒（500ml、1000ml）、烧杯（500ml、1000ml）、长镊子、记号笔、培养皿、酒精灯、恒温水浴锅、玻璃棒等.

1.2 方法

1.2.1 外植体的选择和灭菌

幼嫩叶片，用清水浸泡，温度控制在20℃～25℃，用自来水冲洗3h，剪取1.0～1.5cm见方的块，用清水反复冲洗，然后在超净工作台上用75%酒精溶液处理30s，无菌水冲洗数次，再用1%升汞溶液浸泡5min，用无菌水冲洗5～6次，冲洗速度先快后慢.

1.2.2 培养基的筛选

分别以MS培养基、改良的MS培养基、WPM培养基、1/2WPM培养基（WPM中大量元素减半）、WPM1/2培养基（WPM中各组分减半）为基本培养基，添加1.0mg·L-1IAA，0.5mg·L-1ZT筛选适合叶片诱导愈伤组织的基本培养基.

1.2.3 叶片愈伤组织的诱导

以正交实验因素水平表为依据，采用L9（33）正交表配制9种培养基，叶片剪成1.0～1.5厘米见方的块，在无菌条件下接种于培养基中，每种培养基接种20瓶，每瓶种4～5个，重复3次，经过30d培养统计出愈率，观察愈伤组织的长势.

1.2.4 实验结果评定指标

出愈率（%）=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体的总数×100%.

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对蓝莓叶片诱导愈伤组织的影响

2.1.1 结果

将适量处理好的叶片接种到MS、改良的MS、WPM、1/2WPM、WPM1/2五种培养基上，经过一段时间后，部分叶片出现卷曲、边缘开始出现一些白色的小颗粒，愈伤组织开始生成（图1-2），30d后统计结果并记录.

通过对表3的分析可知，培养基有利于蓝莓叶片愈伤组织的程度由大到小的顺序是WPM1/2>改良MS>WPM>1/2WPM>MS，这表明WPM1/2最适宜叶片诱导愈伤组织的生成.

2.2 不同浓度配比的植物生长剂对蓝莓叶片诱导愈伤组织的影响

2.2.1 结果

在WPM1/2基本培养基中加入不同浓度的ZT、NAA、IAA植物生长剂，在接种20d后同样也会发生叶片边沿卷起，叶片边缘开始出现少量白色的小颗粒（图3-6），30d后统计出愈率.

通过对表4的极差分析，极差R值越大表示该因素的影响也较大，所以对蓝莓叶片诱导愈伤组织的影響大小为NAA>IAA>ZT，这说明NAA对于出愈率的影响最大.可以看出当NAA浓度增大时，出愈率也会随之增加.表中K值越大说明这个水平较高，由表4可以得出，ZT的均值K1>K2>K3，IAA的均值K2>K3>K1，NAA的均值K3>K2>K1，正交实验是较为均一的实验，只是全部实验中一部分，所以在表中未被表现出来，通过实验分析说明最优的处理组合为A1B2C3.同时通过图3、图4、图5、图6看出，蓝莓叶片诱导的愈伤组织在生长过程中会出现由浅绿色变褐色的现象，并且愈伤组织的疏松程度也不同，有的叶片生成的愈伤组织较密，然而有的叶片生成的愈伤组织较为疏松.

正交试验是一种均一性设计试验，不可能包含全部处理组合，因此A1B2C3在实验中就没有显现出来.为验证A1B2C3是最优组合，配制此种培养基20瓶进行验证试验.表5表明，AA1B2C3组合愈伤组织出愈率达到93.3%，明显高于正交表中的9种培养基，进一步对比分析图片（图7、图8）可以发现，两张图片中的愈伤组织颜色不相同，图7中的叶片为绿色，并且较为疏松，而图8中的愈伤组织为浅黄色，并且较为密集，长势明显较好.这说明A1B2C3组合的培养基确实比5号培养基更适合蓝莓叶片诱导愈伤组织生长，这也就是证实了蓝莓叶片诱导愈伤组织的最适的处理实验组合为WPM1/2+0.5 mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.

为了能够更准确分析植物生长剂对蓝莓叶片诱导愈伤组织的影响，因此也进行了方差分析，结果表明NAA具有显著性，说明NAA对于蓝莓叶片诱导愈伤组织的影响最大，此结果和极差分析中的结果相符.

3 结论和讨论

通过实验探究表明蓝莓组织培养的基本培养基中，MS培养基、改良MS培养基、WPM培养基、WPM1/2培养基、1/2WPM培养基均能使蓝莓叶片诱导愈伤组织，从实验数据分析得出WPM1/2培养基的效果最好.实验采用NAA生长素、IAA生长素、ZT分裂素之间的组合，结果得到NAA对于蓝莓叶片诱导愈伤组织影响最大，并且随着NAA浓度的增大，出愈率也随之增大.对于蓝莓叶片诱导的愈伤组织的适合培养条件为WPM1/2+0.5mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.在实验中还发现蓝莓愈伤组织在未接种到分化培养基之前，经过一段时间的生长后会出现不同的变化，即有的愈伤组织由绿色变为褐色，有的愈伤组织由白色变为淡黄色，且愈伤组织较为密集.

本实验中也存在一些的不足，一方面在实验中会出现一定的叶片污染，因此在以后的实验中要更加注意实验过程中的灭菌;另一方面，在实验中发现蓝莓愈伤组织出现了不同程度的褐化现象，可能是植物生长调节剂的浓度或者彼此之间浓度配比不同所导致，这些问题在以后的实验中有待进一步研究.

参考文献：

〔1〕刘欢.”浆果之王”蓝莓的营养保健作用研究[J].中国新技术新产品，2009（19）：228.

〔2〕刘庆忠，赵红军，郑亚芹，等.高灌蓝莓微体繁殖技术研究初报[J].落叶果树，2011（5）：1-3.

〔3〕杨红澎.蓝莓活性成分、吸收代谢及其神经保护作用研究进展[J].卫生研究，2010（4）：525-528.

〔4〕程磊，郭伟，陈胜荣，等.蓝莓组织培养技术研究[J].农业科技通讯，2017（12）：87-90.

〔5〕梁文卫，宋鹏慧，阎聪，等.美登蓝莓试管苗瓶内快速生根试验[J].中国果树，2015（4）：44-47.

〔6〕茨韦特科夫·约旦，赵燕丽，王春，等.引进国外蓝莓品种的组织培养及快繁技术研究[J].黑龙江农业科学，2011（6）：24-26.

〔7〕严家驹，黄作喜，李强.蓝莓繁殖技术的研究进展[J].安徽农学通报，2018，24（14）：43-46+120.

〔8〕熊翠林.兔眼藍莓组培苗瓶内生根技术研究[J].安徽农学通报，2018，24（6）：46-48.

〔9〕王连润，马钧，胡忠荣，等.蓝莓离体快速繁殖研究[J].红河学院学报，2009（10）：17-18.

〔10〕周历萍，王淑珍，来文国.蓝莓组织培养技术研究[J].杭州农业与科技，2011（3）：30-31.