菊叶香藜转录组数据库中FPPS基因的挖掘与生物信息学分析

付苏宏 雷鸣 张勇群 施静 郝豆豆

摘 要：為深入了解菊叶香藜法尼基焦磷酸合酶基因，该研究对菊叶香藜转录组数据库进行挖掘，获取了两条FPPS基因序列（DsFPPS1和DsFPPS2），并对DsFPPS1和DsFPPS2编码蛋白的理化性质、结构、功能、系统进化进行了分析。结果表明：DsFPPS1和DsFPPS2基因分别包含1 029 bp和969 bp的开放阅读框，分别编码342个（DsFPPS1）和322个（DsFPPS2）氨基酸。DsFPPS1和DsFPPS2位于线粒体内，未发现信号肽和跨膜结构，DsFPPS1为稳定蛋白，DsFPPS2为不稳定蛋白。氨基酸序列比对发现DsFPPS1和DsFPPS2序列相似性为60.53%，均含有5个保守结构域和2个天冬氨酸富集区域。DsFPPS1和DsFPPS2二级结构主要由α-螺旋构成，三级结构为由8个α-螺旋形成的α-螺旋束，但DsFPPS2的三级结构中缺少一个α-螺旋A。系统进化树中DsFPPS1与藜科植物聚为一枝，与藜科植物遗传距离较近，而DsFPPS2单独聚为一枝。通过对菊叶香藜转录组数据库中FPPS基因的挖掘与生物信息学分析，为菊叶香藜FPPS的功能研究及其倍半萜类化合物的生物合成研究奠定了一定的理论基础。

关键词：法尼基焦磷酸合酶， 转录组， 菊叶香藜， 基因挖掘， 生物信息学

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2019）06-0831-12

Abstract：Dysphania schraderiana， in the Chenopodiaceae family， is widely distributed in Lhasa （Tibet， China） and used as a traditional medicine. The essential oil of Dysphania schraderiana  contains abundant sesquiterpenes compounds， appeared to possess potential medicinal value. Farnesyl pyrophosphate synthase （FPPS） is a key branch-point enzyme in biosynthesis of terpene. In order to reveal D. schraderiana FPPS gene， the transcriptome database of D. schraderiana was mined and two gene sequences （DsFPPS1 and DsFPPS2） were obtained in this research. Subsequential protein physicochemical property， architectural feature， function and phylogeny relationship analysis of DsFPPSs were also predicted and analyzed. The results showed that DsFPPS1 and DsFPPS2 sequences contained an ORF span of 1 029 bp and 969 bp respectively， encoding 342 （DsFPPS1） and 322 （DsFPPS2） amino acids respectively. The analysis of amino acid composition showed that the dominant components of DsFPPS1 and DsFPPS2 were both nonpolar amino acids. The molecular weight of DsFPPS1 and DsFPPS2 were 39.68 kD and 36.76 kD， respectively. Isoelectric point were 5.11 and 5.65 for DsFPPS1 and DsFPPS2， respectively. Besides， DsFPPS1 protein was predicted to be a stable protein， but DsFPPS2 protein was predicted to be an unstable protein. The amino acid sequence analysis showed that DsFPPS1 and DsFPPS2 had no signal peptide and transmembrane region. The possible localization of DsFPPS1 and DsFPPS2 was both in mitochondria. DsFPPS1 and DsFPPS2 protein exhibited 60.53% sequence identity， and possessed five conserved domain （Ⅰ-Ⅴ） and two characteristic Asp-rich motifs （DDXXD）. The amino acid sequence of DsFPPS1 had higher homology with Chenopodium quinoa， Spinacia oleracea and Beta vulgaris than DsFPPS2. In addition， the secondary structure of DsFPPS proteins mainly consisted of α-helixes， which resulted in a bundle of 8 α-helices in tertiary structure. However， tertiary structure analysis showed that DsFPPS2 protein missed an α-helix compared to DsFPPS1 protein. The result of phylogenetic analysis indicates that phylogenetic relationships of DsFPPS1 protein are close to Chenopodiaceae plants consistent with sequence alignment results， while DsFPPS2 protein is clustered alone in phylogenetic tree. In general， these results provides a certain reference for an insight to molecular function of DsFPPS and the synthetic biology of sesquiterpenes in D. schraderiana.

Key words：farnesyl pyrophosphate synthase， transcriptome， Dysphania schraderiana， gene mining， bioinformatics

菊叶香藜（Dysphania schraderiana）系藜科刺藜属植物，全草入药，具有平喘解痉、解毒、解表、止痛、止痒等功效，是我国传统的药用植物。现代研究发现菊叶香藜精油具有广泛的生物活性，本课题组在前期研究中发现菊叶香藜精油对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长具有显著抑制作用，且呈现出一定的浓度依赖性;此外菊叶香藜精油可浓度依赖性地抑制昆虫玉米象的活力（雷鸣等， 2015）;现已有利用菊叶香藜精油治理植物螨虫的专利（刘志龙等， 2015）。本课题组前期研究中利用GC-MS检测了菊叶香藜精油的化学成分，除了精油中大量的脂肪族化合物（54.232%）外，倍半萜类化合物占有较大的比例（26.846%）。

倍半萜是一类包含有15个碳原子的天然化合物，即包含有3个异戊二烯单元，具有多种结构类型，是新药研发的主要来源之一（王佳等， 2012）。植物萜类化合物主要是由细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径和质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径合成，这两条途径生成萜类化合物的共同前体异戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP），随后一分子的IPP和一分子的DMAPP结合生成香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），一分子的GPP和一分子的IPP在法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase， FPPS）的作用下生成倍半萜类化合物的前体物质法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate， FPP），FPP再在多种倍半萜合酶的作用下生成结构多样的倍半萜化合物（孙丽超等， 2017）。

植物FPPS由基因家族编码，通常有多个FPPS亚型，如拟南芥含有FPPS1和FPPS2两个基因，编码3个FPPS亚型：FPPS1S、FPPS1L和FPPS2，同时敲除两条FPPS基因会造成植物死亡，单个基因敲除不会对植物生长发育造成影响，这种多基因模式可保证某一基因受损时植物仍能正常生存，但不同的亚型仍然具有不同的表达模式与活性，拟南芥FPS1存在于植物整个生命周期，FPS2则主要在种子生长发育阶段发挥作用（Closa et al.， 2010;赵丽等，2018），且FPS2具有更强的催化活性和热稳定性，对氯化钠的抑制作用更敏感（Keim et al.， 2012）。

FPPS是萜类化合物生物合成分支点的关键酶，催化生成重要的中间产物FPP进而合成倍半萜类化合物。鉴于FPPS在倍半萜类化合物生物合成途径中的重要性，而目前尚未见菊叶香藜FPPS基因的研究报道。因此，为了深入探讨菊叶香藜的FPPS，本研究对菊叶香藜花和叶转录组数据库进行挖掘以获取菊叶香藜FPPS （DsFPPS）基因，并利用生物信息学的方法对该基因所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、结构特征、功能以及系统进化方面进行分析和预测，为今后深入研究该酶的结构和功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菊叶香藜的两条FPPS基因来自于实验室前期菊叶香藜转录组研究，花组织转录组与叶组织转录组在SRA （Sequence Read Archive）数据库中的登录号分别为SRX3145242和SRX3145241，其余物种相关的FPPS蛋白序列均来自NCBI （National Center for Biotechnology Information）數据库，物种及序列信息如下：藜麦（Chenopodium quinoa） （CqFPPS：XP_021740746.1）、菠菜（Spinacia oleracea） （SoFPPS：XP_021846881.1）、甜菜（Beta vulgaris） （BvFPPS：XP_010675977.1）、野茶树（Camellia sinensis） （CsFPPS：ANA11766.1）、杧果（Mangifera indica） （MiFPPS：AFJ52720.1）、蓖麻（Ricinus communis）（RcFPPS：AMN82836.1）、橡胶树（Hevea brasiliensis）（HbFPPS：ANJ77846.1）、大戟（Euphorbia pekinensis）（EpFPPS：ACN63187.1）、人参（Panax ginseng）（PgFPPS：AAY87903.1）、竹节参（P. japonicas）（PjFPPS：AKN52395.1）、三七（P. notoginseng）（PnFPPS：AGS79228.1）、常春藤（Hedera helix）（HhFPPS：APV45530.1）、西洋参（Panax quinquefolius）（PqFPPS：ADJ68004.1）、薄荷（Mentha x piperita）（MpFPPS：AAK63847.1）、撒尔维亚（Salvia officinalis）（SolFPPS：AQY54371.1）、丹参（S. miltiorrhiza）（SmFPPS：ABV08819.1）、狭叶薰衣草（Lavandula angustifolia）（LaFPPS：AGQ04160.1）、米团花（Leucosceptrum canum）（LcFPPS：ALT07952.1）、黄芪（Astragalus membranaceus）（AmFPPS：AID51444.1）、甘草（Glycyrrhiza uralensis）（GuFPPS：ADE18770.1）、紫苜蓿（MsFPPS：ADC32809.1）、里氏木霉菌（Trichoderma reesei）（TrFPPS：AFX82678.1）、新月金孢子菌（Emmonsia crescens）（EcFPPS：POS87336.1）、地衣芽孢杆菌（E. crescens）（BlFPPS：ARC74194.1）、荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）（RHcFPPS：ADE44162.1）、牛（Bos taurus）（BtFPPS：AAL58886.1）、黑猩猩（Pan troglodytes）（PtFPPS：JAA28793.1）。

1.2 分析方法

1.2.1 蛋白基本性质分析 开放阅读框（ORF）通过GenBank的在线软件ORF Finder （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）进行查找。获取基因所编码的蛋白质氨基酸序列后，运用多种在线软件分析、预测蛋白的相关信息：蛋白的理化性质利用ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）进行分析;蛋白的亲/疏水性分析应用在线软件ProtScale （http：//web.expasy.org/protscale/）;蛋白的信号肽分析应用在线工具SignalP 4.1 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）;蛋白的跨膜结构域预测应用在线程序TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;蛋白的亚细胞定位预测运用在线软件Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）。

1.2.2 蛋白结构特征与功能分析 蛋白质的二级结构运用在线SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）软件进行预测;蛋白质的三级结构运用Phyre2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在线软件进行预测;利用在线数据库CDD （Conserved Domain Database） （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行保守位点分析。

1.2.3 蛋白氨基酸序列比对及系统进化树构建 用NCBI中的BLASTP （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）模块进行不同物种FPPS氨基酸序列的在线搜索，用ClustalW进行多条FPPS氨基酸序列比对。采用邻接法（Neighbor-Joining）构建FPPS氨基酸序列的系统进化树，使用自展值（Bootstrap）重复检验1 000次，系统进化树的构建和检验通过本地软件MEGA 7.0.14实施。

2 结果与分析

2.1 菊叶香藜FPPS基因挖掘

通过对菊叶香藜转录组数据中核酸序列进行比对和功能注释，挖掘得到两条编号分别为c13053_g1和c12747_g1的FPPS候选基因，分别重命名为DsFPPS1和DsFPPS2。DsFPPS1长度为1 257 bp，其互补链转录翻译为FPPS蛋白，开放阅读框为1 029 bp，开放阅读框对应到DsFPPS1的位置为1 185～155 bp，编码342个氨基酸，编码蛋白命名为DsFPPS1;DsFPPS2長度为1 667 bp，包含一个969 bp的开放阅读框，位置从296～1 264 bp，编码322个氨基酸，编码蛋白命名为DsFPPS2（图1，图2）。

2.2 DsFPPS蛋白的理化性质分析

用在线软件ProtParam分析DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白以及3种藜科植物的FPPS蛋白（藜麦CqFPPS;菠菜SoFPPS;甜菜BvFPPS）的理化性质，结果如表1所示。DsFPPS1蛋白与藜科植物FPPS蛋白较相似，氨基酸长度均为342 aa;分子量在39.67～39.74之间;等电点（pI值）在5.01～5.12;酸性氨基酸比例在15.5%～16.4%之间，碱性氨基酸比例在13.8%～14.7%之间，极性中性氨基酸比例在25.3%～26.5%之间，非极性氨基酸比例在42.4%～44.4%之间，差异均较小;不稳定系数值均小于40，属于稳定蛋白。而DsFPPS2蛋白与DsFPPS1蛋白以及藜科植物FPPS蛋白差异较大，氨基酸个数为322 aa，长度短于其他FPPS蛋白;分子量为36.76;等电点（pI值）为5.65;碱性氨基酸和极性中性氨基酸的比例与其他FPPS蛋白差异较小，比例分别为13.1%和27.3%，酸性氨基酸的比例低于其他FPPS蛋白，为13.1%，非极性氨基酸的比例高于其他FPPS蛋白，为46.5%;不稳定系数值大于40，为不稳定蛋白。

运用在线软件ProtScale分析DsFPPS蛋白的亲/疏水性，蛋白的每一位氨基酸的亲/疏水性用分值表示，正值则表示疏水，负值则表示亲水，绝对值越大则表示其亲/疏水性越强。DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的亲/疏水性预测结果如图3所示，在DsFPPS1蛋白氨基酸序列的第202位处有最高分值2.611，表明其疏水性水性较强;第101位有最小分值-2.733，表明其亲水性较强;在DsFPPS2蛋白氨基酸序列的第68位处有最高分值2.800，表明其疏水性水性较强;第118位有最小分值-2.578，表明其亲水性较强。

2.3 DsFPPS蛋白的功能结构域分析

采用NCBI中的CDD工具、本地软件ClustalW以及相关文献（Chen et al.， 1994; Guo et al.， 2015; 李永波等， 2012）寻找FPPS蛋白的保守结构域，结果显示FPPS家族蛋白共包含5个保守区域（Ⅰ～Ⅴ），以及分别位于保守区域Ⅱ和Ⅴ的两个天冬氨酸富集区域（DDXXD，X为任意氨基酸）：FARM （First Aspartic Rich Motif）和SARM （Second Aspartic Rich Motif），如图4所示。DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均属于FPPS家族，序列比对结果显示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白具有60.53%的相似性，均具有FPPS家族蛋白特征的两个天冬氨酸富集区域FARM和SARM，以及序列保守区域Ⅰ～Ⅴ。天冬氨酸富集区域（DDXXD）是金属离子Mg2+结合位点，Mg2+再与底物的磷酸基团结合，从而发挥催化作用（Christianson， 2017）。DsFPPS1蛋白对应的五个保守区域序列分别为GGKLNR （45～50， Ⅰ）、EWLQAYFLVLDDIMDNSHTRRG （83～104，Ⅱ）、GQMIDL （160～165，Ⅲ）、KT （190～191，Ⅳ）、GIYFQVQDDYLDCFGDPEFIGKIGTDIEDFK （225～255，Ⅴ），FARM为DDIMD （93～97），SARM为DDYLD （232～236）。DsFPPS2蛋白对应的五个保守区域分别为SRKLNR （25～30，Ⅰ）、QWLVGCVLVLDDLLDASHTRRG （63～84，Ⅱ）、GEMIDL （140～145，Ⅲ）、KT （170～171，Ⅳ）、GIYFQAQDDYLDCFGDPKKSGKIGSDIEDFK （205～235，Ⅴ），FARM为DDLLD （73～77），SARM为DDYLD （212～216）。

2.4 DsFPPS蛋白的信号肽、跨膜结构域与亚细胞定位分析个氨基酸残基的短肽，在分泌蛋白合成结束后将其切除，因此可以通过分析蛋白的氨基酸序列是否具有分泌肽来判断蛋白是否为分泌蛋白。利用在线软件SignalP 4.1对DsFPPS基因所编码的蛋白进行分析，结果显示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均不具有信号肽，属于非分泌蛋白（图5：A，B）。然后，我们利用TMHMM在线软件分析DsFPPS基因编码蛋白的跨膜结构，结果显示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均不具有跨膜结构（图6：A，B）。此外，Cell-PLoc 2.0在线软件的亚细胞定位分析表明，DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均存在于细胞的线粒体内。

2.5 DsFPPS蛋白的结构特征分析

蛋白的二级结构进行分析和预测，结果表明（图7） DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的二级结构组成类似，都是主要由α-螺旋组成，其比例分别为59.36%和64.29%，此外，DsFPPS1蛋白的二级结构由19.88%的无规则卷曲、11.70%的延伸链以及9.06%的β-转角组成，DsFPPS2蛋白的二级结构由15.53%的无规则卷曲、10.87%的延伸链以及9.32%的β-转角组成。

利用在线软件Phyre2对DsFPPS基因所编码的DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的三级结构进行预测，以Artemisia spiciformis的FPPS蛋白（PDB ID：4KK2）为模板，采用线串法同源建模构建DsFPPS1蛋白（79%相似性）和DsFPPS2蛋白（63%相似性）的三级结构，结果如图8所示。与大多数的FPPS蛋白类似，DsFPPS1蛋白的空间结构中总共包含有13个α-螺旋，其中有10个长α-螺旋（A～J），α-螺旋A和α-螺旋B形成一个发夹结构，α-螺旋C至α-螺旋J共8个α-螺旋则形成α-螺旋束，围绕形成一个中央腔;此外还包含有3个小α-螺旋（α-1、α-2、α-3），嵌入到α-螺旋H和α-螺旋I之间，酶的催化反应则发生在α-螺旋腔底。DsFPPS2蛋白的三级结构与DsFPPS1蛋白类似，但只包含有12个α-螺旋，9个长α-螺旋（B～J）和3个小α-螺旋（α-1，α-2，α-3），不包含α-螺旋A，因此缺少α-螺旋A和α-螺旋B形成的发夹结构。

2.6 DsFPPS蛋白的系统进化分析

采用本地软件MEGA 7.0.14对DsFPPS1蛋白、DsFPPS2蛋白和来自于GenBank数据库的24条FPPS蛋白序列进行分子系统进化分析，N-J法（Neighbor-joining）构建系统进化树。图9结果表明，FPPS蛋白的系统进化树聚类分为植物、真菌、动物和细菌4个类群，具有较显著的种族特异性。细菌单独聚为一大枝，动物、真菌和植物聚为一大枝，该分枝中植物单独聚为一枝，另一枝又分化为动物和真菌两大枝。在植物分枝中，唇形科、五加科、藜科、蝴蝶花科、大戟科植物各自聚为一枝，菊叶香藜的DsFPPS1蛋白分布于藜科植物分枝中，说明其与藜科植物的亲缘关系较近，而菊叶香藜的DsFPPS2蛋白单独聚为一枝。

3 讨论与结论

倍半萜类化合物作为植物的次级代谢产物具有较强的生物活性（朴英花和朴惠顺， 2012），例如青蒿素（Artemisinin， C15H22O5）为倍半萜内酯药物，是有效的抗疟疾特效药（Tu， 2011）;吉马酮（Germacrone， C15H22O）具有抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗菌、止咳、利胆等多种功效（Wu et al.， 2017）;β-桉叶醇（β-Eudesmol， C15H26O）可通过作用于瞬态受体电位锚蛋白1 （TRPA1）和自主神经系统从而刺激食欲（Ohara et al.， 2017）;雪松醇（Cedrol， C15H26O）可剂量依赖性地加速纤维母细胞生长以及增加1型胶原蛋白和弹性蛋白的生成（Mu et al.， 2012）;缬草烯酸（Valerenic acid， C15H22O2）可变构调节GABA-A受体从而发挥抗焦虑活性（Becker et al.， 2014）。

FPPS是植物萜类化合物生物合成途径中分支点上的关键酶，经FPPS的催化可生产倍半萜类化合物的前体，菊叶香藜精油中倍半萜类的生物合成需要此酶的参与。目前，随着转录组学研究的崛起，我们从包含有海量信息的转录组数据中挖掘FPPS候选基因，获得了两条FPPS基因：FPPS1和FPPS2，并对这两条基因的开放阅读框进行了预测并进行了进一步的生物信息学分析，结果显示，FPPS1蛋白和FPPS2蛋白序列相似度达60.53%，均含有FPPS蛋白特征的5个保守结构域（Ⅰ～V）以及两个天冬氨酸富集区域（FARM和SARM）。然而，FPPS1蛋白和FPPS2蛋白的穩定性存在差异，FPPS2蛋白为不稳定蛋白，且FPPS2蛋白结构中缺少α-螺旋A，因此其三级结构中缺少由α-螺旋A和α-螺旋B组成的发夹结构，该结构可能会影响其稳定性。在分子进化分析树的植物分枝中，FPPS2蛋白与其他植物分开，单独聚为一枝，FPPS2蛋白可能是一类新的FPPS亚型。植物FPPS通常由基因家族编码，含有多个FPPS亚型，不同亚型在植物不同的生长阶段和组织中发挥作用，拟南芥种子中FPS2的缺失可升高HMGR（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶）活性（Closa et al.， 2010），从而调节植物中“碳流”的流向，控制类异戊二烯种类的比例。

在前期的菊叶香藜转录组研究中发现，FPPS1在花和叶组织中的表达均高于FPPS2，且FPPS1蛋白的稳定性优于FPPS2蛋白。由此可推测，FPPS1蛋白广泛且长期存在于菊叶香藜植物中，而FPPS2的出现则具有“时-空”特异性，但菊叶香藜FPPS各亚型的功能、活性、表达以及调节机制仍需要更进一步的研究。总的来说，该研究对菊叶香藜转录组数据库中的FPPS基因进行了挖掘与生物信息学分析，为菊叶香藜FPPS基因今后的基础研究和开发应用奠定了理论基础。

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