甲烷氧化菌的分离鉴定及其发酵条件优化

顾华兵 沈阳 周淑鑫 范建华 李尚民 吴兆林 金波 储卫华

摘 要：甲烷氧化菌是一类能以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的细菌。本研究从污泥中分离、筛选获得一株甲烷氧化菌MO-01，根据该菌株的形态学、生理生化试验和16S rDNA序列同源性分析，证实该菌株与Methylobacterium zatmanii菌株有99%的同源性，属于Methylobacterium属。甲烷氧化菌MO-01的实验室培养条件筛选、研究表明，该菌株以甲烷为碳源，最佳培养温度是37℃，最适PH值为7.0，铜离子浓度为30 umol/L。本研究为今后甲烷氧化菌的放大发酵培养和动物源性单细胞蛋白的生产奠定了科学基础。

关键词：甲烷氧化菌;菌株筛选;菌种鉴定;16S rDNA

中图分类号：Q-3

文献标识码： A

甲烷氧化菌（Methanotroph）是一种能够以甲醇、甲烷、甲酸等作为生长所需的碳源以及能源的一种甲基氧化菌[1]。据科学测定，湿地系统内产甲烷菌产生的90%以上的甲烷气体都会被甲烷氧化菌进行氧化利用，用于合成自身细胞中的组成成分[2]。有研究表明甲烷氧化菌能够用以生产单细胞蛋白[3]。单细胞蛋白又称微生物蛋白，是指从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充[4]。研究已经表明，使用微生物产生的单细胞蛋白安全无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，可以用作饲料促进畜禽生产，提高饲料利用率，代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉等蛋白补充饲料，具有较高的附加值[5]。由细菌以甲烷为原料生产的新型单细胞蛋白的蛋白含量69%～80%，远远高于工业生产饲料15%～20% 的蛋白含量，具有较高的经济效益和广阔的市场空间[6-7]，因此分离出能以甲烷为碳源生长的甲烷氧化细菌有着重要的意义。

本研究从污泥中分离了一株能够以甲烷为碳源和能源的菌株，并对其生物学性状进行研究，利用16S rDNA技术对筛选的菌株进行鉴定，并利用单因子控制的方法对其培养条件进行优化筛选，为后期进一步放大发酵培养和甲烷单细胞蛋白的生产提供良好科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 筛菌土样

筛菌土样采集于河床淤泥和生活垃圾填埋场5年以上填埋区土壤。

1.1.2 初筛选及富集培养基

无机盐基础培养基配方为：Mg SO4·7H2O 0.2 g、 KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、（NH4）2SO4 1.0 g、NaCl 1.0 g。以甲烷作为富集培养基碳源，以0.5 %无水甲醇作为固体培养基碳源;单一碳源无机盐固体培养基向上述液体培养基中加入1.5%～2%琼脂。所有培养基配方及配置均由中国药科大学微生物教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 甲基氧化菌的富集培养

称取土样10.0 g，加入到带玻璃珠的装有100 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，30 ℃摇床震荡30 min，静置10 min，得到土样浸出液。取1.0 mL土样浸出液上清加入到装有90 mL无机盐培养液的100 mL盐水瓶中，用50升注射器注入甲烷气体。随后将盐水瓶置于恒温摇床中在150 r/min，30 ℃条件下富集培养，直至锥形瓶中培养液明显红色浑浊。选取出现红色浑浊较快且浑浊度较高的样品组用于目的菌株的筛选[8]。

1.2.2 甲烷氧化菌的分离纯化

甲烷氧化菌同样能利用甲醇，因此在分离纯化甲烷氧化菌时以甲醇代替甲烷制备固体培养基。以重复富集3次后获得的粉红色富集培养液为材料，采用平板分区划线的方法将富集培养液接种于含0.5%甲醇的无机盐固体培养基上培养5～10天，挑取平板上的粉红色的单菌落接种于新的固体培养基中培养，重复3次，获得的纯化的菌株即为甲烷氧化菌。

1.2.3 分离菌株的生理生化及分子生物学鉴定

1.2.3.1 生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对获得的甲基氧化菌MO-01进行形态学染色、运动性、生理生化鉴定[9]。

1.2.3.2 16S rDNA鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和1492R（5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）对提取纯化后的DNA进行16S rDNA扩增。对PCR产物进行测序，并利用NCBI的Blast，將测序结果与Genbank中公开的16S rDNA序列进行核苷酸同源性分析，并用MEGA 7.0软件进行系统发育分析。

1.2.4 甲基氧化菌MO-01培养条件优化筛选

1.2.4.1 初始pH值对甲基氧化菌MO-01生长的影响

将目的菌株接种于无机盐液体培养基，设定初始pH分别为4、5、6、7、8、10，37℃摇床培养96 h后570 nm测定菌液OD值。

1.2.4.2 温度对甲基氧化菌MO-01生长的影响

将菌液接种于pH7.0的无机盐培养基，实验选取了20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃ 六个温度下对目的菌株进行摇床培养后测定菌液OD570值。

1.2.4.3 铜离子浓度对甲基氧化菌MO-01生长的影响

在无机盐培养基加入浓度为0、5、10、20、30、40 umol/L的CuSO4， 37℃，150 rpm摇床培养96 h后测定菌液OD570值。

1.2.4.4 不同碳源对甲基氧化菌MO-01生长的影响

分别用麦芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作为碳源，加入上述无机盐液体培养基中，37℃摇床培养96 h后570 nm测定菌液OD值。

2 结果与分析

2.1 甲烷氧化菌MO-01形态学、生理生化和16S rDNA鉴定

通过富集培养、利用平板分区划线、转接等方法从污泥中分离出10株能够利用甲烷的细菌，其中一株在單位时间内消耗甲烷能力最强、生长速度较快，命名为甲烷氧化菌MO-01，对MO-01形态学和生理生化试验，该菌在以甲醇为碳源的琼脂平板上经48 h培养后菌落为粉红色，表面光滑，菌落边缘整齐，直径0.8～1.2 mm，革兰氏阴性短杆菌、无芽孢、无荚膜，在液体培养基中呈粉红色菌液（图1）。甲烷氧化菌MO-01产H2S试验、吲哚试验为阴性;甲基红试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验和明胶液化试验均为阳性。

对甲烷氧化菌MO-01进行16S rDNA序列扩增并测序，碱基长度为1 427 bp，与GenBank中公开的细菌16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，BLAST结果显示，MO-01的16S rDNA基因序列与Methylobacterium zatmanii 7211菌株的同源性最高（图2），达99%，所以确定该菌为甲基杆菌属。基于16S rDNA序列、生化鉴定以及表征性状，确定该分离菌株MO-01为甲基杆菌属。

2.2 初始pH值对甲烷氧化菌MO-01生长的影响

对不同pH值条件下甲烷氧化菌MO-01生长情况进行测定，结果如图3所示，MO-01在pH值

4-5时几乎停滞生长，随着pH值升高，生物量增加，到达7.0时最高，随后随着pH值升高，生物量有所下降，表明菌株MO-01最适生长pH值=7.0，属中性培养菌。而国内邓永翠[10]从青藏高原湿地分离了2株酸性甲烷氧化菌，江皓[11]等从煤矿土壤中分离的甲烷氧化菌呈碱性。因而甲烷氧化菌的最适PH值大小应该与分离菌所在的环境酸碱条件相关。

2.3 温度对甲烷氧化菌MO-01生长的影响

在液体培养基pH值为7.0时，研究温度对MO-01生长的影响，如图4所示，OD值在37℃时为最高，说明甲烷氧化菌MO-01的最适生长温度为37℃，在37～40℃温度范围内，细菌的生长量都比较高，随后随着温度升高而下降。这与赵艮贵[12]等人报道的最适温度15～30℃有较大差异，可能与分离菌的原始生长条件有关。

2.4 铜离子浓度对甲烷氧化菌MO-01生长的影响

如图5所示，铜离子适量添加，对甲烷氧化菌

MO-01生长有明显的促进作用，在30 umol/L CuSO4·5H2O添加量时，细菌的生物量达最高，但随后又随着添加量的增加而降低。表明MO-01的生长明显受铜离子的调控。这与王晓丽[13]等报道的基本一致。

2.5 不同碳源对甲烷氧化菌MO-01生长的影响

分别用0.5%的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉和甲醇作为碳源研究甲烷氧化菌MO-01对碳源的利用能力，结果如图6所示，甲烷氧化菌MO-01对所提供的碳源都能利用，对淀粉的利用率最低，对甲醇最高。这与国内刘晓宁[14]等以甲醇为唯一碳源时，菌株生长很快但菌体生物量较低的报道不一致，可能与分离菌本身固有的特性相关。

3 结论

本研究从两类土壤样品中分离出10株甲烷氧化菌，其中一株甲烷利用能力较强，革兰氏阴性，这与目前已有报道的甲烷氧化菌都为革兰氏阴性菌且没有芽孢这一结果一致[15]。结合形态学、生理生化实验与16S rDNA生物学鉴定，该菌属于Methylobacterium属细菌，并命名为MO-01。

通过MO-01菌的分离纯化、最佳培养条件优化筛选研究，结果表明，MO-01菌在37℃、pH值70、铜离子浓度30 umol/L时生物量达到最大，为最适培养条件。

参考文献：

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（责任编辑：于慧梅）

Isolation， Identification of Methanotrophic Bacteria and

Optimization of its Fermentation Conditions

GU Huabing1， SHEN Yang2， ZHOU Shuxin3， FAN Jianghua1， LI Shangmin1，

WU Zhaolin1， JIN Bo1，  CHU Weihua3*

（1.Jiangsu Institute of Poultry Sciences，Yangzhou 225125， China; 2.Yangshe Animal Epidemic Prevention Staion， Zhangjiagang 215637， China;

3. China Pharmaceutical University， Nanjing  210009， China）

Abstract：

Methanotrophs are a kind of bacteria which can use methane as the sole carbon source and energy for their anabolism and catabolism. A strain of methyl oxidizing bacteria was isolated ，named MO-01，and screened by its morphology， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence homology analysis.The results showed the MO-01 strain had 99% homology with the Methylobacterium zatmani strain， and was proved to belong to the genus Metylobacterium.The strain of the optimum growth condition was PH 7.0，and copperion concentration was 30 umol/L.This experiment laid a good foundation for the amplification of the Mo-01 strain ，and the production of single￣cell protein.

Key words：

methanotrophs bacteria; screening; identification; 16S rDNA