奶及奶制品中乳糖检测方法的研究进展

焦艳翠 赵领军 范丽霞 赵善仓

摘 要：综述了奶及奶制品中乳糖的检测方法的研究进展，包括传统的重量法、红外光谱法、分光光度法、差分pH和酶法等以及新型的高效液相色谱法，并对各个方法的原理及其应用情况进行了阐述。

关键词：奶及奶制品;乳糖;乳糖不耐症

乳糖是一种重要的能量物质。测定乳糖含量可以为乳糖不耐症个体选择饮食提供参考。本文综述了奶及奶制品中乳糖检测方法的研究进展，包括传统的重量法、红外光谱法、分光光度法、差分pH和酶法等以及新型的高效液相色譜法，并对各个方法的原理及其应用情况进行了阐述。

1 乳糖及其特殊的营养作用

奶是一种由雌性哺乳动物乳腺分泌的复杂的流体食物，是哺乳动物发育过程中碳水化合物的主要来源，占哺乳期消耗能量的40%，几乎包含维持新生儿生命和成长所需的所有营养物质[1]。奶所含的营养成分中，糖类起到关键的作用，其含量可达到10%[2]，并且几乎仅以乳糖的形式存在（占牛奶中糖分的98%）。乳糖对于新生命最初几个月的神经组织发育是很重要的，主要作用是为新生儿提供半乳糖以合成神经结构（髓鞘）。D-乳糖以α-乳糖和β-乳糖（比率是2∶3）两种形式存在，这取决于葡萄糖中吡喃糖的形式（α或β），葡萄糖多以β-吡喃糖形式存在。这些异构体也有不同的物理性质，如对于水的溶解度，β-乳糖比α-乳糖溶解度大[3-4]。乳糖在乳腺组织中由血液中的一部分葡萄糖转化为半乳糖，这涉及到复杂的乳糖合成酶，它由半乳糖基转移酶和α乳白蛋白组成[5]。乳糖的消化吸收需要在乳糖酶的作用下将乳糖水解形成单糖，被肠道吸收并进入到血液中。如果乳糖酶不存在或是含量较低，乳糖不会被水解和吸收，而是进入结肠或是大肠，被这里的微生物分解利用，就会产生多种气体及短链脂肪酸，渗透压升高，导致腹胀、排气增多、腹痛和腹泻等病症，即乳糖不耐症[6]，因此，对于乳糖不耐症病人，乳糖的测定是非常重要的[7-8]。

2 乳糖的测定方法

目前已经建立了大量用于测定乳糖含量的方法，包括传统的重量分析法、红外光谱法、分光光度法和酶法，以及高特异性、高灵敏度的高效液相色谱示差折光检测器法和高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器法。

2.1 重量法

重量法是基于硫酸铜在醛糖和酮糖存在条件下与氢氧化钾发生反应生成沉淀物氧化亚铜，对生成的氧化亚铜进行称重，通过经验表查出与氧化亚铜量相当的乳糖含量[8-9]。

2.2 红外光谱法

红外光谱法是基于乳糖分子中羟基在波长为1 042 cm-1[10]处吸收红外能量。早期的仪器完全基于滤波器，使用一对（样本和参照）光学过滤器，来选择一个波长测量乳糖。现在利用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）中干涉仪在中红外区域内获得物质完整的光谱信息，从而获得大量的计算和数据处理性能测定乳糖的含量[11-14]。Kittivachra等[14]利用傅里叶变换红外线对牛奶中粗蛋白、脂肪、乳糖、非脂干物质、干物质含量进行分析，结果表明，乳糖含量为4.59%±0.12%。赵武奇团队[15]用InfraXact多功能近红外分析仪和正交试验设计，研究了不同预处理和校正方法对建模效果的影响，建立了液态奶制品中脂肪、乳糖和蛋白质质量含量的定标模型，最优模型对乳糖的相对标准偏差为4.12%，相对误差为2.82。近红外光谱分析法能够实现对牛奶中乳糖含量的快速、无损定量检测。何吉子等[16]利用傅立叶变换近红外光谱（FT-NIR）技术结合偏最小二乘法（PLS）对婴幼儿配方奶粉中的乳糖进行快速检测分析，测定的样品中的乳糖值与高效液相色谱（HPLC）法测定的乳糖值之间的平均相对误差均≤0.67%，相对标准偏差（RSD）均≤0.88%，均符合误差范围。

2.3 分光光度法

分光光度法测定乳糖主要是因为乳糖与苯酚、氢氧化钠、苦味酸和亚硫酸氢钠等物质反应生成橘红色的络合物，在一定浓度范围内，橘红色络合物颜色的深浅与乳糖含量成正比，然后用分光光度计进行测定从而得出乳糖的量。该方法比较简单、快速，但不适用于大量样品同时测定[17]。并且不能区分其他还原糖和乳糖，所以适用于原奶和成分比较简单的奶制品中的乳糖含量的测定[18]。陶兆林等[19]将牛奶样品去除蛋白质之后，加热情况下与Na2CO3发生显色反应，用分光光度计测定吸光度值。结果表明，乳糖检测回收率为99.7%～103.0%，并且蔗糖对乳糖测定基本没有影响。蒋珍菊等[20]利用亚铁氰化钾和硫酸锌作为沉淀剂，苯酚、氢氧化钠、苦味酸、亚硫酸氢钠作为发色剂，沸水加热情况下发生显色反应，用分光光度计测定吸光度值。此方法的精密度为0.55%、重复性为1.809%、加标回收率为100.434%，结果表明，蔗糖和淀粉对吸光度的影响不大，葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖对吸光度有较大影响。

2.4 酶法

酶法测定乳糖已有大量的报道[21-23]，其原理是利用乳糖在酶的作用下水解生成葡萄糖和半乳糖，随后测定一种游离单糖的量，样品中乳糖的含量由水解前后样品中单糖含量的差异判定。

2.4.1 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶法 目前测量半乳糖最常用的酶方法是基于其被β-半乳糖脱氢酶氧化生成半乳糖醛酸，同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。通过计算添加半乳糖脱氢酶前后NADH在340nm处的吸光度值的差异得出乳糖的含量[24]。这种方法具有特异性和准确性，但是需要在紫外范围内进行测量。Shapiro等[[21]开发了用硫代-NAD代替NAD，在可见光405或415nm处进行测定的方法，实现了使用酶标仪同时测定几个样品中D-半乳糖的含量。

2.4.2 微分pH法 用于测定奶样品中乳糖和乳果糖的微分pH技术是基于酶促反应引起的pH变化。通过测定β-半乳糖苷酶处理前后葡萄糖和ATP在己糖激酶（HK）存在下发生反应引起的pH变化来得出的。这种方法需要在ATP存在条件下，在样品中加入β-半乳糖苷酶和葡萄糖激酶的混合物，3h后测量pH变化，再加入HK，监测4h内pH变化，以观察d-果糖-6-磷酸形成从而计算出乳糖的量[25]。

2.5 高效液相色谱法

2.5.1 高效液相色谱-示差折光检测法（HPLC-RIC）HPLC是应用最广泛的技术之一，因具有样品前处理方法简单、快速的优势，被广泛用于分析食品中多种碳水化合物。高效液相色谱紫外检测器可以吸收低波长的紫外线，可直接检测碳水化合物。然而在低波长（低于200nm）紫外区域，其灵敏度低和选择性较差，并且需要使用高质量和昂贵的试剂。最常见的乳糖检测分析系统是HPLC-RIC，高山等[26]就通過优化试验条件利用此方法对乳粉中乳糖进行检测，得到的样品测定结果比按照国标（GB 5413.5—2010）条件测定的结果高出7%。

2.5.2 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测 几种有效的分离碳水化合物的色谱方法中，应用最为广泛的是反相色谱和阳离子交换色谱[27-31]。反相色谱分离是基于疏水相互作用，主要是相对极性溶剂、非极性分析物和非极性固定相之间的排斥力。烷基化和氨基烷基化硅胶是最常用的固定相，甲醇水溶液或乙腈水溶液作为流动相，通过疏水作用、极性相互作用和分配进行分离[32-33]。传统的吸附色谱几乎完全被离子交换色谱（IEC）取代。碳水化合物通过两种不同类型离子交换剂电荷的差异来实现分离。如阴离子和阳离子的离子交换剂，其化合物分别带负电荷和正电荷[34-35]。基于阳离子交换高效液相色谱的方法已经被用于测定乳制品中的乳糖测定。使用不同的固定相和流动相，比如使用糖分析柱，流动相中加入含钙胺作为抗衡离子进行分析[29]。

高效阴离子交换色谱（HPAEC）结合脉冲安培检测法（PAD）是另外一种更敏感的方法。相比对非衍生碳水化合物的分析，该方法是一种高灵敏度和分辨率的分析技术。碳水化合物的分离和洗脱顺序是基于它们的酸解离常数pKa值的差异，实际上高效阴离子交换色谱利用碳水化合物的弱酸性，在高pH条件下，强阴离子交换固定相进行的选择性分离。交换柱用烷基季铵盐官能团化的聚（苯乙烯-二乙烯基苯）为固定相[36]。HPAEC-PAD存在的主要问题是保留时间密切相近的碳水化合物可能被共洗脱。Cataldi等[37]优化了一种快速灵敏的HPAEC-PAD方法，将10～12mmol/L NaOH和1～2mmol/L醋酸钡加入到热牛奶中进行改性，这种方法可以使奶和奶制品中乳果糖和乳糖以及其他碳水化合物得到有效的分离和定量[37-38]，最低检出限（LOD）低于1mg/L[39]，具有很高的性价比。

3 结论

乳糖是新生儿时期非常重要的营养素，成年人反而容易出现乳糖不耐受现象。本文综述了传统、现代各种牛奶中乳糖测定的方法，考虑到乳糖不耐受的普遍程度，乳糖分析应选择最合适的方法，综合灵敏度、精度、准确度和分析速度等重要参数。

参考文献

[1]Fox P F，Mcsweeney P L H.Dairy chemistry and biochemistry[J].Molecular Aspects of Medicine，1998，24（1-3）：3-9.

[2]Ganzle M G.Enzymatic synthesis of galacto-oligosaccharides and other lactose derivatives（hetero-oligosaccharides）from lactose[J].International Dairy Journal，2012，22（2）：116-122.

[3]Idda I，Spano N，Ciulu M，et al.Gas chromatography analysis of major free mono-and disaccharides in milk：Method assessment，validation，and application to real samples[J].Journal of Separation Science，2016，39（23）：4577-4584.

[4]Harju M，Kallioinen H，Tossavainen O.Lactose hydrolysis and other conversions in dairy products：technological aspects[J].International Dairy Journal，2012，22（2）：104-109.

[5]EFSA NDA Panel（EFSA Panel on Dietetic Products，Nutrition and Allergies）.Scientific opinion on lactose thresholds in lactose intolerance and galactosaemia[J].EFSA Journal，2010，8（9）：29.

[6]李兴.酶法降解乳糖及低乳糖发酵酸乳的发酵工艺技术研究[D].石家庄：河北科技大学，2013.

[7]Brown-Esters O，Namara M P，Savaiano D.Dietary and biological factors influencing lactose intolerance[J].International Dairy Journal，2012，22（2）：98-103.

[8]Lactose.In Official Methods of Analysis，15th ed[M].Helrich，K.，Ed.;Association of Official Analytical Chemists（AOAC）：Washington，DC，USA，1990：810.

[9]Official Method 930.28.Lactose in Milk.Gravimetric Method[S].In Official Methods of Analysis of AOAC International;（AOAC）：Washington，DC，USA，2005.

[10]Lactose.Infrared Milk Analysis[S].In Official Methods of Analysis，18th ed.;Horwitz，W.，Ed.;（AOAC）：Washington，DC，USA，2005.

[11]Linch J M，Barbano D M，Schweisthal M，et al. Precalibration evaluation procedures for mid-infrared milk analyzers[J].Journal of Dairy Science，2006，89（7）：2761-2774.

[12]Official Method 972.16 Lactose in Milk.Mid-Infrared Method[S].In Official Methods of Analysis of AOAC International;AOAC：Washington，DC，USA，2005.

[13]IDF.International Standard 141C.Whole Milk-Determination of Milkfat，Protein and Lactose Content，Guidance on the Operation of Mid-Infrared Instruments[S].Int.Dairy Fed.：Brussels，Belgium，2000.

[14]Kittivachra R，Sanguandeekul R，Sakulbumrungsil R，et al.Determination of essential nutrients in raw milk[J].Songklanakarin Journal of Science and Technology，2006，28（Suppl 1）：115-120.

[15]谷月，赵武奇，李晓丹，等.近红外光谱技术对液态奶制品中乳糖、脂肪及蛋白质的定量检测[J].宁夏大学学报，2012，33（4）：377-380.

[16]何吉子，陈秀明，梁瑞婷，等.应用傅立叶变换近红外光谱检测婴幼儿配方奶粉中的乳糖含量[J].中国酿造，2019，38（3）：193-196.

[17]孙式兴，侯彩云，祝晓芳，等.乳粉中乳糖数字图像检测方法的研究[J].食品科技，2007（9）：206-209.

[18]钟宁，侯彩云.三种乳糖检测方法的比较[J].食品科技，2011，36（7）：263-265.

[19]陶兆林，張世满，司友琳.分光光度法测定乳制品中的乳糖[J].中国卫生检验杂志，2001，11（1）：50-51.

[20]蒋珍菊，林芳栋.比色法测定原料乳中乳糖含量研究[J].食品科技，2012，37（6）：299-303.

[21]Shapiro F，Shamay A，Silanikove N.Determination of lactose and D-galactose using thio-NAD+ instead of NAD+[J].International Dairy Journal，2002，12（8）：667-669.

[22]ISO 5765—1：2002.Dried ice-mixes and processed cheese-determination of lactose content-part 1：enzymatic method utilizing the glucose moiety of the lactose[S].International Organization for Standardization：Geneva，Switzerland，2002.

[23]ISO 5765—2：2002.Dried ice-mixes and processed cheese-determination of lactose content-part 2：enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose[S].International Organization for Standardization：Geneva，Switzerland， 2002.

[24]Official Method 984.15.Lactose in Milk.Enzymatic Method[S].In Official Methods of Analysis of AOAC International（AOAC）：Washington，DC，USA，2005.

[25]Milk：Determination of lactose content.enzimatic method using difference in pH[S].ISO Standard 26462;International Organization of Standardization：Geneva，Switzerland，2010.

[26]高山，程敏，张洪元，等.液相色谱法测定乳粉中乳糖方法优化[J].食品安全质量检测学报，2017，8（6）：2294-2297.

[27]Richmond M L，Barfuss D L，Harte B R，et al.Separation of carbohydrates in dairy products by high performance liquid chromatography[J].Journal of Dairy Science，1982，65（8）：1394-1400.

[28]West L G，Llorente M A.High performance liquid chromatographic determination of lactose in milk[J].Journal Association of Official Analytical Chemists，1981，64（4）：805-807.

[29]Pirisino J F.High performance liquid chromatographic determination of lactose，glucose and galactose in lactose-reduced milk[J].Journal of Food Science，1983，48（3）：742-744.

[30]Mullin W J，Emmons D B.Determination of organic acids and sugars in cheese，milk and whey by high performance liquid chromatography[J].Food Research International，1997，30（2）：147-151.

[31]Elliot J，Dhakal A，Datta N，et al.Heat-induced changes in UHT milks.Part 1[C].Aust.J.Dairy Technol，2003，58（1）：3-10.

[32]Honda S.High-performance liquid chromatography of mono-and oligosaccharides[J].Analytical Chemistry，1984，140（1）：1-47.

[33]Manzi P，Pizzoferrato L.HPLC determination of lactulose in heat treated milk[J].Food and Bioprocess Technology，2013，6（3）：851-857.

[34]Kennedy J F，Pagliuca G.Oligosaccharides[M].In Carbohydrate Analysis.A Practical Approach;（The Practical Approach Series）;Chaplin，M.F.，Kennedy，J.F.，Eds.;Oxford University Press：New York，NY，USA，1994;Chapter 2.

[35]Macrae R.Applications of HPLC to food analysis[M].In HPLC in Food Analysis;Macrae，R.，Ed.;Academic Press：San Diego，CA，USA，1988;Chapter 2.

[36]Cataldi T R I，Campa C，De Benedetto G E.Carbohydrate analysis by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection：the potential is still growing[J].Fresenius Journal of Analytical Chemistry，2000，368（8）：739-758.

[37]Cataldi T R I，Angelotti M，Bufo S A.Method development for the quantitative determinationof lactulose in heat-treated milks by HPAEC-with pulsed amperometric detection[J].Analytical Chemistry，1999，71（21）：4919-4925.

[38]Cataldi T R I，Angelotti M，Bianco G.Determination of mono-and disaccharides in milk and milk products by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection[J].Analytica Chimica Acta，2003，485（1）：43-49.

[39]Monti L，Negri S，Meucci A，et al.Lactose，galactose and glucose determination in naturally “lactose free” hard cheese：HPAEC-PAD method validation[J].Food Chemistry，2017，220：18-24.

（責任编辑 唐建敏）