粘红酵母RG-31产虾青素发酵条件优化

罗秀针 林燕燕 陈雅静 郑金华

摘 要：以粘红酵母RG-31为研究对象，通过单因素试验和正交试验对其合成虾青素的培养基和发酵条件进行初步的研究。试验结果表明：粘红酵母RG-31最适培养基为葡萄糖10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、K2HPO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1;最适培养条件为pH 6，培养温度28℃，转速240 r·min-1，培养时间60 h后，虾青素含量为7.41 μg·mL-1，是优化前（2.84 μg·mL-1）的2.61倍，生物量为20.5 g·L-1，是优化前（10.8 g·L-1）的1.90倍。

关键词：虾青素;粘红酵母;培养基;发酵优化

中图分类号：TQ 926 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）09-004

Abstract： The culture medium and fermentation conditions for the synthesis of astaxanthin from Rhodotorula glutinis RG-31 were studied by single factor experiment and orthogonal experiment. The results showed that the optimal culture medium of Rhodotorula glutinis RG-31 was glucose 10 g·L-1， beef extract 3 g·L-1， yeast powder 5 g·L-1， K2HPO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1. The optimal culture condition was the pH of 6， the culture temperature of 28℃， and the rotate speed of 240 r·min-1. After culturing for 60 h， the content of astaxanthin was 7.41 μg·mL-1， which was 2.61 times of that before optimization （2.84 μg·mL-1）， and the biomass was 20.5 g·L-1， which was 1.90 times of that before optimization （10.8 g·L-1）.

Key words： Astaxanthin; Rhodotorula glutinis; Culture medium; Fermentation optimization

蝦青素（Astaxanthin，AST），即3，3’-二羟基-β，β’胡萝卜素-4，4’-二酮，为萜烯类不饱和化合物，是一种氧化型的类胡萝卜素[1-2]。广泛分布在自然界中，是甲壳类动物、鲑鱼、鸟类以及其他生物中的主要色素。虾青素具有极强的抗氧化性能[3]，其抗氧化性能较α-生育酚强百倍以上，具有“超级维生素E”之称。动物试验表明，虾青素具有很强的生物学活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗脂质过氧化活性、预防心脑血管疾病以及增强免疫功能的作用[4-6]，因而在食品添加剂、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景。同时，虾青素作为良好的着色剂在贵重鱼类水产养殖方面具有重要价值。

过去虾青素主要是从甲壳类动物提取，但是提取的费用较高。目前虾青素可通过化学合成，但化学合成虾青素不仅成本高[7];而且结构与天然的虾青素不同，多为顺式结构。因此，急需寻找廉价的虾青素来源，来满足市场需求。利用酵母合成虾青素具有成本低、易操作、环境友好等优势，且色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、饲料添加剂等优点，是一种极具产业化前景的天然虾青素资源[8]。本研究采用的粘红酵母RG

-31是经诱变后筛选获得的高产虾青素突变株，通过单因素试验和正交试验，对该菌株的发酵培养基和发酵主要条件进行了优化，进一步提高虾青素的得率，并降低生产成本，为今后的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 粘红酵母RG-31由实验室筛选诱变后获得虾青素产量较高的菌株。

1.1.2 培养基 斜面培养基：葡萄糖15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1，琼脂 20 g·L-1， pH 自然。

发酵基础培养基：葡萄糖 15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1， pH 自然。

1.2 主要仪器及药品

葡萄糖、蛋白胨、丙酮、二甲基亚砜、甲醇试剂购自生工生物工程（上海）有限公司。台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、恒温摇床ZWY-2112B（上海智城分析仪器制造有限公司）、紫外分光光度计（上海精科仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养条件 发酵基础培养基：葡萄糖 15 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，KH2PO4 1 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1， pH 自然。初始发酵条件：250 mL三角瓶装液量35 mL，接种量为5%，培养温度为29℃，转速为250 r·min-1，培养时间为72 h。

1.3.2 单因素试验

（1）最佳碳源的确定。选择葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、饴糖、糊精、淀粉、麦芽糖、果糖8种不同碳源，初始浓度为15 g·L-1，取代发酵基础培养基中的葡萄糖，其他条件不变，比较不同碳源对粘红酵母RG-31生物量和虾青素产量的影响。

（2）最佳氮源的确定。分别选择无机氮源3种：（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，有机氮源4种：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米浆为氮源;氮源浓度为8 g·L-1，取代发酵基础培养基中的蛋白胨，其他条件不变，比较不同氮源对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

（3）最佳初始pH的确定。分别将培养基的初始pH调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他条件不变，比较初始pH对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

（4）最佳装液量的确定。在250 mL三角瓶装液量分别为25、30、35、40、45 mL，其他条件不变，比较装液量对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

（5）最佳培养温度的确定。分别将培养温度调整为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，其他条件不变，比较温度对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

（6）最佳发酵时间的确定。发酵时间分别为48、60、72、84 h，其他条件不变，比较发酵时间对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

（7）最佳接种量的确定。接种量分别取1%、2%、3%、4%、5%，其他条件不变，比较接种量对粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量的影响。

1.3.3 正交试验 在单因素试验基础上，以虾青素含量及粘红酵母RG-31的生物量为指标，选取初始pH（A）、葡萄糖濃度（B）、牛肉膏和酵母粉配比浓度（C）以及温度（D）为考察因素，设计L9（34）正交试验，各因素与水平见表1。

1.3.4 虾青素的提取与测量

（1）虾青素提取。采用二甲基亚砜法[8]，取10 mL发酵液离心，用蒸馏水洗涤菌体，加入3.5 mL 55℃的二甲基亚砜，充分振荡后，加入15 mL丙酮提取虾青素，在480 nm下检测丙酮提取液的吸光值。

（2）虾青素含量的测定方法。虾青素含量的测定采用分光光度法[9]。计算公式：细胞虾青素质量浓度（μg·mL-1）=（A×Va）/（E×Vf）。

（3）生物量的测定。采用干重法[10]，取10 mL发酵液于4000 r·min-1离心15 min，去上清，将离心管放置于50～60℃恒温箱放置24 h后称重。

2 结果与分析

2.1 碳源对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

碳源种类和添加剂量对微生物菌体生长和产物的产量均有很大影响。本试验选择8种不同碳源，初始浓度为15 g·L-1，比较不同碳源对粘红酵母RG-31生物量和虾青素产量的影响，结果如图1所示：在供试的碳源中，葡萄糖为碳源时其生物量和虾青素含量最高，D-半乳糖、饴糖、糊精、淀粉、麦芽糖的效果较差，因此，选用葡萄糖为培养基的碳源。

2.2 氮源对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

分别选择无机氮源3种：（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，有机氮源4种：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米浆为氮源;浓度为8 g·L-1，比较不同氮源对粘红酵母RG-31的生物量和虾青素产量的影响，结果如图2所示：在供试的不同氮源中，有机氮源以牛肉膏和酵母粉为最佳，其生物量和虾青素含量均较高;无机氮源虽能较快被微生物吸收利用，但是成分单一，不能够提供全面均衡的营养。因此选用牛肉膏、酵母粉为复合氮源。

2.3 初始pH对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

选择不同pH为起始发酵条件，结果如图3所示，当pH为5左右时，较利于菌体自身的生长。培养基初始pH为6 左右对合成虾青素较有利。故选择起始pH为6。

2.4 装液量对红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

粘红酵母为好氧微生物，其生长和合成虾青素都会受到氧气的影响。通过调节摇瓶装液量研究通气量对粘红酵母RG-31发酵的影响，结果如图4所示，250 mL三角瓶装液为35 mL时，粘红酵母RG-31的生物量和产虾青素产量最高。当装液量超过35 mL时，酵母生物量明显降低，因此装液量以35 mL宜。

2.5 温度对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

温度对粘红酵母RG-31的影响结果如图5。结果表明：当温度为24℃时，生物量最高;当温度在26℃时，虾青素含量较高，故发酵温度选择26℃。

2.6 发酵时间对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

由图6可见，发酵48 h后生物量增长缓慢，而虾青素的含量则在60 h出现最大值，72 h后生物量和虾青素含量都呈下降趋势。因此发酵时间取60 h。

2.7 接种量对粘红酵母RG-31生物量和产虾青素产量的影响

由图7可见，生物量随着接种量的增加而降低，虾青素含量的峰值出现在接种量为3%时，故接种量选择3%。

2.8 粘红酵母RG-31发酵条件正交试验

利用正交设计助手ⅡV3.1软件作极差和方差分析，结果如表3、4。表3极差分析表明，以虾青素含量为指标，各因素的主次关系为A>C>B>D。表3方差分析表明， pH、牛肉膏和酵母粉的配比对虾青素产量影响较显著。结合极差与方差分析，以虾青素含量为主要指标，其最佳培养条件为A2B1C2D3，即起始pH为6，葡萄糖10 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，酵母粉5 g·L-1， KH2PO4 1.5 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1，培养温度28℃。粘红酵母RG-31在此条件进行发酵培养，虾青素含量为6.48 μg·mL-1，生物量为17.7 g·L-1。

2.9 粘红酵母RG-31的生长曲线

以正交试验的最优组合为发酵培养基，即pH为6，葡萄糖10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、KH2PO4 1.5 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1、CaCl2 0.2 g·L-1，培养温度28℃。从10 h开始，每隔8 h取样，测其虾青素含量、生物量及pH，绘制粘红酵母R-31菌株的生化曲线。在整个试验过程中发酵液的pH从初始的6.0随着酵母菌的生长逐步降低至5.0，又随着虾青素积累到最大值时上升并稳定在5.4。如图8可见，粘红酵母RG-31生长过程可以划分为生长期、对数期、稳定期、衰亡期4个阶段，在20 h左右进入对数生长期，细胞生长干重迅速增大，同时虾青素不断积累，40 h左右进入稳定期，细胞干重趋于稳定，虾青素继续合成，在64 h时，虾青素含量达到最高值，此时虾青素含量为7.41 μg·mL-1，生物量为20.5 g·L-1，分别是优化前培养基发酵的2.61倍及1.90倍。该菌株的衰亡期不明显，可能是由于该菌株的细胞壁太厚，菌体不易自溶。

3 小结与讨论

通过摇瓶试验，对粘红酵母RG-31的产虾青素培养基组分及摇瓶发酵条件进行初步研究。确定粘红酵母RG-31产虾青素的优化发酵培养基为：葡萄糖10 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，酵母粉5 g·L-1， KH2PO4 1.5 g·L-1，MgSO4 0.5 g·L-1，CaCl2 0.2 g·L-1。發酵条件为：初始pH6.0，250 mL三角瓶装液量为35 mL，培养温度28℃，转速为240 r·min-1，发酵时间为60 h，虾青素含量可达到7.41 μg·mL-1，生物量达到20.5 g·L-1。通过优化试验，使粘红酵母RG-31虾青素产量大幅度提高。

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（责任编辑：柯文辉）