水稻品种空育131稻瘟病抗性基因座Pik鉴定及抗性分析

郑祥正

摘 要：粳稻品种空育131具有熟期早、丰产稳产及耐低温冷害等优点，自引入我国后，已成为北方水稻种植区的重要品种之一，对该地区的粮食生产起着重要作用。利用Pik基因座的Pik、Pi1、Pikp、Pikm等功能基因的特异分子标记，对空育131基因型进行检测及分析，并在福建省上杭县稻瘟病重发区進行稻瘟病抗性鉴定。结果表明：空育131品种中含有稻瘟病抗性基因Pik，在福建上杭县稻瘟病重发区田间表现苗瘟0级、叶瘟4级、穗颈瘟3级、综合抗性评价中抗。因此，空育131可作为抗源或育种材料。

关键词：水稻;空育131;稻瘟病;抗性基因;分子标记

中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）09-003

Abstract： The japonica rice variety Kongyu 131 had the advantages of earlymaturity， high and stable yield and low temperature and cold damage resistance. Since it was introduced into China， it has become one of the important varieties in the northern rice growing area， which played an important role in the food production in this area. By using the specific molecular markers of functional genes such as Pik、Pi1、Pikp、Pikm in Pik genetic loci， the genotype of kongyu 131 was detected and analyzed， and the resistance to rice blast was identified in the area with heavy rice blast in Shanghang County， Fujian Province. The results showed that the rice blast resistance gene Pik was contained in Kongyu 131， which showed 0 grade of seedling blast， 4 grade of leaf blast and 3 grade of neck blast in the area with heavy rice blast in Shanghang County， Fujian Province. Therefore， Kongyu 131 could be used as resistant material or breeding material.

Key words： Rice; Kongyu 131; Rice blast; Resistance gene; Molecular marker

由稻瘟病菌Magnapothe oryzae引起的稻瘟病导致水稻严重减产，并降低稻米品质[1]。长期生产实践表明，推广高抗稻瘟病的水稻种质是防治稻瘟病最为环保有效的措施[2]，而稻瘟病抗性鉴定是发掘抗性基因、抗性育种和推广等工作中的核心环节。Pik抗性基因座位于水稻第11号染色体的长臂上，目前已在该位点克隆了至少7个稻瘟病抗性基因（Pi1、Pikp、Pikm、Pikh、Pik、Pike和Piks）[3-5]，在水稻抗病育种和推广方面具有重要价值[4-7]。研究表明，Pik基因座等位基因介导的抗性由2个紧密连锁、功能独立的NBSLRR序列共同作用[6-9]。据此，可将Pik基因座分为K单元型（K1K2功能型）和N单元型（N1N2非功能型）[4]。

将抗病品种Kusabue（Pik）、Tsuyuake（Pikm）、K60（Pikp）、C101LAC（Pi1）等Pik基因座的2个NBSLRR序列和感病品种日本晴同源区域进行比对分析，发现该位点可分为K单元型（K1K2功能型）和N单元型（N1N2非功能型）[5]。进一步研究发现，Pikm、Pik、Pikp和Pi1 基因型取决K1、K2区间的6个SNP。因此，基于Pik基因座等位基因序列多态性开发的分子标记能够检测Pik位点的不同等位基因。粳稻品种空育131具有熟期早、丰产稳产及耐低温冷害等优点，在我国东北地区大规模种植。本研究对水稻品种空育131的Pik基因座进行K/N单元型多态性分析及基因分型，研究结果将为水稻稻瘟病抗性育种和福建地区品种推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

粳稻品种空育131、日本晴。

1.2 水稻叶片DNA提取及抗病基因特异性分子标记检测CTAB法提取水稻样品DNA。利用Pik基因座基因特异性分子标记，进行PCR 扩增。

PCR 扩增体系25 μL：水稻基因组DNA（20～30 ng·μL-1）1 μL，10×PCR 缓冲液 12.5 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O补足至25 μL。

反应程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55～60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃ 5 min。

酶切体系为10 μL： PCR产物8 μL，10×酶切缓冲液1.5 μL，限制性内切酶 0.5 μL，37℃酶切4 h，酶切产物在8%的PAGE胶电泳检测。

1.3 稻瘟病菌鉴定抗病性

2018年在福建省上杭县进行田间稻瘟病抗性鉴定，分别在苗期、分蘖盛期和成熟期调查苗瘟、叶瘟和穗颈瘟。

2 结果与分析

2.1 空育131抗稻瘟病Pik位点K/N单元型多态分析

利用K型标记Ku1GT和Ku2GT可以从IRBLkKa（Pik）和空育131的基因组分别检测到1600 bp和4879 bp的片段，而日本晴无扩增到产物，确定空育131存在K-单元型（K1K2功能型）[4]（图1～2、表1）。

利用dCAPS2953、Pi1SNP、Pikp、PikmInDel、PikhFM等标记对空育131的Pik位点进行检测，发现其基因型与Pik相同，都不能被Kpn酶切，确定空育131含有Pik基因，而IRBLkKp（Pikp）PCR产物可以被Kpn酶切 （表1，图3） 。

2.2 空育131在上杭县的抗性鉴定

在福建省上杭县对空育131和日本晴进行田间抗性鉴定，结果表明：空育131苗瘟0级，叶瘟4级，穗颈瘟3级，综合抗性评价中抗;对照日本晴苗瘟9级，叶瘟8级，穗颈瘟9级，综合抗性评价高感（表2）。由此可见，空育131具有较好的抗性。

3 讨论与结论

稻瘟病是水稻重要的病害之一，对粮食高产稳产构成严重的威胁。防治稻瘟病最经济有效的手段是利用水稻自身的抗性基因。虽然目前至少在水稻中发现超过100个稻瘟病抗性位点，其中有27个已经被鉴定与克隆，但由于这些抗病基因接近一半成簇分布在第1、6和11染色体，并且这些基因簇内的基因高度同源，对稻瘟病菌株的抗谱存在交叉。因此，利用传统的稻瘟病生理小种很难将它们划分开来，从而限制了这些抗性基因的应用。

Pik基因组区域存在着多个在序列上高度相似的候选基因，近年来，随着分子遗传学及病理学的发展，在该基因座中至少克隆了包括Pik、Pikm、Pikp、Pi1、Piks、Pike 和Pikh等7个基因，且序列高度同源。这些基因对中国不同稻区稻瘟菌生理小种较广谱和持久的抗性不同，其中Pik、Pikm、Pikp基因对广东、湖南、四川、江苏等稻瘟菌株的抗性频率达到90%以上;Pikm、Pik、Pikp基因对东北地区稻瘟菌株的抗性频率低于50%[8]。因此，鉴定并利用该基因座的不同功能基因，可有效提高抗病育种效率。

空育131引自于日本，自1983年以来累计推广面积超过964万hm2[12]，在中国的粮食生产中发挥了重要的作用。由于该品种主要在北方粳稻区推广应用，因此推测其中含有的抗原有可能对南方的稻瘟病菌小种具有一定的抗性。本试验结果表明，该品种在福建省国家级稻瘟病重发多发鉴定区上杭县具有很好的抗性;进一步研究发现，空育131含有抗性基因Pik，因此，它可作为抗原，供南方水稻抗性育种应用。

参考文献：

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[11]WARSCHEFSKY E，PENMETSA R V，COOK D R，et al.Back to the wilds：Tapping evolutionary adaptations for resilient crops through systematic hybridization with crop wild relatives[J].American Journal of Botany，2014，101（10）：1791-1800.

[12]国家水稻数据中心.空育131（垦鉴30-31）[EB/OL].[2019-06-01].http：//www.ricedata.cn/variety/varis/600008.htm.

（责任编辑：柯文辉）