关于多管发酵法测定粪大肠菌群的探讨

王晓彤　孙义峰　汪进生

摘 要：目前，测定粪大肠菌群的标准方法有多管发酵法、滤膜法、酶底物法、纸片快速法。目前最常用的方法为多管发酵法。生态环境保护部发布的《HJ347.2-2018水质粪大肠菌群的测定多管发酵法》改进了《HJ/T347-2007水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法》标准的不足，完善了方法原理的表述，并明确给出了15管法和12管法的检出限等。对于具体工作中的重点，本文做了详细的介绍。

关键词：粪大肠菌群;方法;测定

1 粪大肠菌群的定义

粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，其主要来源于人畜粪便。通过对粪大肠菌群的测定，可以了解水体受粪便污染的程度。它又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms）。44.5℃培养 24 h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2 多管发酵法测定大肠菌群的方法原理

将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查 MPN 表，得出粪大肠菌群浓度值。

3 方法的检出限

12管法为3MPN/L，15管法为20MPN/L。

4 干扰和消除

4.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集时加入硫代硫酸钠溶液消除干扰。

4.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集时加入乙二胺四乙酸二钠溶液消除干扰。

5 培养基保存

配制好的培养基避光、干燥保存，必要时在5℃±3℃冰箱中保存，通常瓶装及试管装培养基不超过3～6 个月。配制好的培养基要避免杂菌侵入和水分蒸发，当培养基颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。

6 样品采集

点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ/T 494 和HJ/T 91 的相关规定执行。注意采集微生物样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。清洁水体的采样量不低于400 ml，其余水体采样量不低于100 ml。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水3～5 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3 min 灭菌或用70%～75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。

7 样品保存

采样后应在2 h 内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2 h 内检测。

8 试验过程

8.1 初发酵试验

将接种后的试管，在37℃±0.5℃下培养24 h±2 h。发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。产酸和产气的试管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。特别注意产气不明显的，要轻拍试管，不能视为阴性。

8.2 复发酵试验

轻微振荡在初发酵试验中显示为阳性或疑似阳性（只产酸未产气）的试管，用经火焰灼烧灭菌并冷却后的接种环将培养物分别转接到装有EC 培养基的试管中。在44.5℃±0.5℃下培养24 h±2 h。转接后所有试管必须在30 min 内放进恒温培养箱或水浴锅中。培养后立即观察，倒管中产气证实为粪大肠菌群阳性。复发酵时，要特别注意接种后30min放进培养箱中，这个是新标准做的要求。

9 质量保证和质量控制

9.1 培养基检验

更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验，将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠埃希氏菌 Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes）制成浓度为300～3000 MPN/L 的菌悬液。若使用的是定性标准菌株，配制方法为先进行预实验，摸清浓度后按目标为300～3000 MPN/L 稀释;若使用的是定量标准菌株，则可按照给定值直接稀释。稀释后分别取相应水量的菌悬液按接种的要求接种于试管中，然后按初发酵试验和复发酵试验要求培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应。

9.2 空白对照

每次试验都要用无菌水按照步骤进行实验室空白测定。

9.3 阳性及阴性对照

定期按照8.1进行阳性及阴性对照试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

10 废物处理

使用后的废物及器皿须经 121℃高压蒸汽灭菌30min或使用液体消毒剂（自制或市售）灭菌。灭菌后，器皿方可清洗，废物作为一般废物处置。

11 其他问题

在实际配置培养基的过程中，经过高温灭菌后，培养液中的小倒管仍有气泡的问题。通过经验，发现70℃以下打开高温灭菌锅，可以减少气泡的存在。如果时间允许，温度越低越好。黎尧等对此做了详细研究，作者发现在灭菌锅内温度下降到80℃及以上时开盖，带有气泡的试管数量几乎无变化;80℃～ 60℃开盖，带有气泡的试管数量逐渐减少;60℃～ 40℃开盖，带有气泡的试管数量明显降低;40℃～ 25℃開盖带有气泡的试管数量下降趋于稳定;待灭菌锅内温度冷却至室温时开盖，气泡去除率最高。同时，作者还做了无孔硅胶塞和有孔硅胶塞的对比，发现无孔硅胶塞更有利于气泡的去除[1]。

参考文献

[1]黎尧，张绍斌.多管发酵法测定水质粪大肠菌群的探讨[J]环境与发展.2019（05）116-118