陈皮复方止咳含片壳聚糖絮凝纯化工艺的优选

谭娥玉,林信亨,马少锋,汤启勋,唐兴荣

(江门市五邑中医院，广东 江门 529000)

陈皮复方止咳含片处方由《医宗金鉴》中的加味二陈汤加减化裁而成[1]，该方由陈皮、生姜、桔梗、苏子、甘草组成，是江门市名中医唐兴荣主任中医师在临床上使用多年的验方，具有理气化痰、清利咽喉的功效,主要用于治疗风痰引起的初期咳嗽，经多年临床证实该方能有效治疗咳嗽、痰多诸症。

该止咳复方在临床上以汤剂入药，为使制剂方便服用及携带，结合方中有效成分的性质，同时较好保留汤剂用药的优势，本课题组拟将该方水提液研制为含片，使药物可直达患处并迅速起效，从而更好地缓解咳嗽症状。由于该处方日剂量较大，水提液出膏率较高，对剂型的选择有一定限制，为了提高疗效、减少服用剂量、增加制剂的稳定性，需进一步纯化。因此，本文采用壳聚糖絮凝剂对陈皮复方止咳含片的水提液进行纯化研究，采用正交试验设计，选取总黄酮质量浓度、橙皮苷质量浓度及除杂率为综合评价指标，采用层次分析法(AHP)确定各指标权重系数，优选出最佳纯化工艺条件，为制备陈皮复方止咳含片提供可靠的依据。

1 仪器与材料

1260 InfinityⅡ型HPLC仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站(美国Agilent公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；DHG-9030电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；WH-800超声波清洗机(济宁万和超声电子设备有限公司)；SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；HH-3A数显恒温三温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)；TC-15套式恒温箱(海宁市新华医疗器械厂)；ME104电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；T6紫外可见光-分光光度计(北京普析通用有限责任公司)；Best-S30超纯水机(芷昂仪器上海有限公司)。

陈皮、生姜、桔梗、苏子、甘草饮片均购自广州市集芝宝中药有限公司；橙皮苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17032502)；壳聚糖(上海麦克林生物科技有限公司，批号：C10092999)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，乙酸为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 陈皮复方止咳含片提取液制备 按处方量称取陈皮等药材800 g，置于20 L圆底烧瓶，浸泡30 min，煎煮2次，第1次加入8倍量水，第2次加入6倍量水，每次煎煮1 h，合并煎液，滤过，浓缩成生药比为1∶1的药液，即每1 mL浓缩液相当于1 g原药材。

2.1.2 壳聚糖絮凝剂的制备 临用前配制，称取壳聚糖5 g，以1%乙酸溶液300 mL浸渍2 h后，快速搅拌使溶解，再用1%乙酸溶液定容至500 mL，充分搅拌后，静置24 h，即得。

2.1.3 提取液纯化液的制备 按正交表中的设计，量取药液比(g∶mL，下同)1∶1的提取液，分别加水稀释配制为药液比1∶2、1∶4、1∶6的溶液100 mL，在药液比为1∶2、1∶4、1∶6的药液中，采用“慢加快搅”的方式，加入壳聚糖溶液，在相应絮凝温度下，100 r/min速度下搅拌4 min，于相应絮凝温度下水浴静置一定时间后，滤过，滤液转移至200 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.2 橙皮苷质量浓度的测定[2]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，4 μm),流动相：甲醇-醋酸-水(体积比35∶4∶61)；流速：1.0 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：25 ℃，进样量：5 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容成0.45 mg/mL溶液，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取生药比为1∶1的提取液5 mL，置20 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺少陈皮的阴性对照样品，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.2.5 系统适用性验证 依次取对照品、供试品、阴性对照品溶液适量，以“2.2.1”项下色谱条件进样分析，供试品中橙皮苷色谱峰与其他相邻色谱峰能较好地分离，阴性无干扰，理论塔板数按橙皮苷计算不低于2 000，表明方法专属性良好,结果见图1。

6050403020100220180140100602001412108642002468101214161820t/minABCmAUmAUmAU11

1.橙皮苷。

图1橙皮苷对照品(A)、供试品(B)与阴性对照品(C)溶液的高效液相色谱图

Figure1HPLC chromatograms of hesperidin standard sample (A)，sample (B) and negative control (C)

2.2.6 线性关系、定量限及检测限 精密吸取橙皮苷对照品溶液，逐级稀释得质量浓度为0.045 0、0.056 3、0.112 5、0.225 0、0.450 0 mg/mL的橙皮苷系列溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以橙皮苷质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=6 495.431 9X+8.989 0，r=1.000，表明橙皮苷在0.225～2.250 μg范围内呈良好线性关系。按信噪比为10∶1、3∶1分别计算得橙皮苷的定量限为3.50 ng，检测限为1.05 ng。

2.2.7 精密度、稳定性、重复性试验 精密度、稳定性、重现性试验的RSD值分别为0.33%(n=6)、0.67%(n=5)、1.01%(n=6)，表明方法符合要求。

2.2.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量药液比为1∶1的提取液6份，每份2.5 mL，置于20 mL容量瓶中，分别加入0.450 0 mg/mL橙皮苷对照品溶液3.5 mL，按“2.2.3”方法制备供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件进样分析，记录峰面积，计算加样回收率，结果平均回收率为96.34%，RSD值为2.05%(n=6)，表明方法回收率良好。

2.3 总黄酮质量浓度的测定(UV法)[3-5]

精密吸取0.450 0 mg/mL橙皮苷对照溶液适量，加甲醇稀释为0.380 0 mg/mL对照品溶液，分别精密吸取0.2、0.3、0.5、0.7、0.8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇为空白溶剂，在吸收波长284 nm处测定吸光度，以质量浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明总黄酮在7.60～30.40 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.033 2X+0.043 1，r=0.999 9。

2.4 除杂率的测定

分别精密吸取“2.1”项下的提取液及各组纯化液10 mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿，水浴蒸干，于105 ℃烘箱干燥至恒定质量，取出，置干燥器中冷却30 min后精密称定，按照公式：除杂率=(提取液干膏质量-纯化后干膏质量/药液浓缩比)/提取液干膏质量×100%，计算除杂率。

2.5 陈皮复方止咳含片壳聚糖絮凝纯化工艺的优化

2.5.1 正交试验法优选纯化工艺 参考文献[6-9]及单因素考察预试验结果，确定药液比、壳聚糖溶液用量、絮凝温度、静置时间是壳聚糖纯化效果的主要影响因素，将该4个影响因素作为考察对象，各取3个水平，以橙皮苷质量浓度、总黄酮质量浓度及除杂率为评价指标，进行L9(34)正交试验，优选最佳纯化条件，正交试验因素及水平见表1。

2.5.2 层次分析法(AHP)确定各考察指标的权重系数 根据复方中药味含量多少、各成分药理作用强弱，并兼顾本研究的纯化效果，将总黄酮质量浓度、橙皮苷质量浓度、除杂率作为权重指标予以量化。采用1～9标度法对3项指标进行两两比较评判重要性[10]，将3项指标分成3个层次，并确定各指标优先顺序：总黄酮>橙皮苷>除杂率，构建成对比较的判断优先矩阵，按照各指标重要程度赋予各指标间的相对评分，优先矩阵安排见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

表2 各指标3个层次的优先矩阵Table 2 Priority matrix of three Levels of indicators

权重系数计算：按照几何平均法计算各指标的权重系数[11-17]，并对各指标权重系数进行一致性评价，相关计算如下：

根据优先矩阵及公式(1)计算初始权重系数(Wi′)：

(1)

式中：m为受检验层次目标数，a1～am为矩阵两两比较的评分。

经计算各指标成分初始权重系数W1′=2.102 9，W2′=0.729 6，W3′=0.264 5。

按照公式(2)计算归一化权重系数，得各指标成分权重系数W1=0.669 4，W2=0.242 6，W3=0.087 9。

(2)

一致性检验：CR为随机一致性比率，定义CR=CI/RI作为衡量所得权重系数是否合理的指标，一致性指标CI=(λmax-m)/(m-1)，式中：m为次级目标数，矩阵的最大特征根(λmax)：

(3)

平均随机一致性指标RI值为0.58(矩阵阶数=3)。经计算，λmax=3.007，CI=0.003 5，CR=0.006<0.1，说明指标优先比较判断矩阵符合一致性要求，计算的权重系数有效可行。

2.5.3 纯化工艺的优选结果 由表3中直观分析可知，影响陈皮复方止咳含片提取液纯化工艺效果的因素依次为：C>B>A>D，即絮凝温度>壳聚糖溶液用量>药液浓缩比>静置时间；表4中方差分析结果可知，C因素和B因素对陈皮复方止咳含片提取液纯化工艺效果的影响有统计学意义(P<0.05)，A因素和D因素的影响则均无统计学意义。取各因素较高水平组合，得最佳工艺参数A3B2C1D1，即药液比为1∶6，壳聚糖溶液用量为15%，水浴絮凝温度为30 ℃，静置时间为3 h。

表3 正交试验设计与结果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

注：采用归一化法计算各指标分数，结合权重系数计算各试验组的权重分数，权重分数=[(总黄酮质量浓度/最大总黄酮质量浓度)×0.669 4+(橙皮苷质量浓度/最大橙皮苷质量浓度)×0.242 6+(除杂率/最大除杂率)×0.087 9]×100。

表4 方差分析结果Table 4 The results of variance analysis

2.5.4 验证性试验 按处方比例称取药材120 g，按“2.1”项下提取液制备方法提取，水提液平均分为4份，其中3份按照最佳纯化工艺进行验证试验，1份作为对照，计算总黄酮、橙皮苷的保留率和除杂率，结果见表5，计算得RSD值分别为2.22%、1.40%、2.81%，表明所选工艺条件总黄酮和橙皮苷损失少，除杂效果佳。

表5 验证试验结果Table 5 The results of verification test

3 讨论

中药复方具有化学成分高度复杂性和整体治疗性，如果仅对复方中的个别成分进行定性、定量研究，既不能有效保障制剂的疗效和质量，同时也不符合中医整体论治的指导原则。因此，在中药复方制剂工艺研究过程中，应注重疗效与物质基础的直接相关性，以复方的有效活性成分群为检测指标，建立多指标评价方法优选制剂工艺[18-19]。本方中的君药陈皮具有理气健脾、燥湿化痰之功效，其主要有效成分为橙皮苷，结合方中具有药理活性的黄酮类成分群(总黄酮)，以及纯化工艺研究中常用的除杂率，以三者共同作为综合评价纯化效果的指标，使除杂的同时也能较好保留提取液的有效成分，确保药物的疗效。为了降低仅凭主观决定权重系数引起的评价误差，增强总体评价的科学合理性，本研究采用了主观、客观相结合的层次分析法(AHP)来确定各指标权重系数，既体现对各项评价指标的主观重视程度，也兼顾了各指标的相互联系和影响。

壳聚糖发挥纯化作用是基于其阳离子和长链架桥的双重结构，使壳聚糖分子与药液中的杂质充分耦合形成絮凝物，有效去除杂质的同时又能较好保留药液中的有效成分，并且无毒无味，可生物降解，不会造成二次污染，已被广泛应用于制药和食品加工领域[6-9]。本研究采用壳聚糖溶液作为絮凝剂，在预实验纯化过程中发现，搅拌速度快慢对纯化效果有直接影响，搅拌过快可导致絮凝剂未能与提取液充分结合就被搅散，形成较小颗粒，较难过滤，搅拌过慢又会使壳聚糖溶液絮凝成团，参考文献[7]及多次预试，确定在100 r/min速度下搅拌4 min效果最佳，且易于过滤。另外，壳聚糖在pH 3.5～5.5范围内能发挥较强的絮凝作用，经测定本方提取液pH=4.32，故在纯化工艺中无需调节提取液的酸碱度[20]。在此基础上，采用正交设计考察药液浓缩比、壳聚糖溶液用量、絮凝温度、静置时间，优选最佳纯化工艺。通过层次分析法及正交实验设计，优选了最佳纯化工艺：药液比为1∶6，壳聚糖溶液用量为15%，水浴絮凝温度为30 ℃，静置时间为3 h。该方法与传统的醇沉法比较，价格便宜，操作简单方便，可缩短生产周期，适宜工业化大生产。