基于聚类和主成分分析的江西产区防己UPLC指纹图谱研究

梁浩明，张文芳，吴志权，徐彤彤，胡梅，林碧珊

(国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

防己Stephaniae Tetrandrae Radix为防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore的干燥根，具有祛风止痛、利水消肿之功，主要用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒[1]。防己的传统道地产区是江西省，由于野生资源破坏、分布区域缩小、年产量递减、人工种植质量不稳定及品种混杂等不利因素，严重制约着该地区药材的临床应用[2-4]。

目前，中药主要以水作为转化媒介应用至临床和生产。水溶性的双苄基异喹啉类成分-粉防己碱和防己诺林碱是防己的专属性和药效成分[5-6]，是2015年版《中国药典》含量测定的指标成分。但经水煎煮后防己的极性成分种类繁多、药理活性各异，仅以2种生物碱为指标难以反映该药材质量和临床疗效。本文拟采用UPLC法，通过收集江西省5市15个产地防己药材，以饮片水煎煮提取物为研究对象，建立了江西产地防己水提物的UPLC指纹图谱，并采用相似度分析、系统聚类分析和主成分分析对其质量进行评价，为防己药材的种质、药材来源及内在质量评价基础提供依据。

1 仪器与试药

ACQUITY UPLC液相系统，Waters公司(二元高压泵，柱温箱，自动进样器和二极管阵列检测器)； CORTECS T3 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，Waters公司； MS105DU型电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；Synergy UV型超纯水制备仪(MILLIPORE公司)。

防己诺林碱对照品(批号110793-201606，质量分数98.8%)、粉防己碱对照品(批号110711-201609，质量分数99.2%)均购自中国食品药品检定研究院；木兰花碱对照品(批号150813，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；无水乙醇为分析纯；乙腈和磷酸均为色谱纯；超纯水由MILLIPORE纯水仪制备。15批防己药材分别于2016年8月—2018年3月收集于江西不同种植产地，详细信息见表1，经本单位黄国满鉴定均为防己Stephaniae Tetrandrae Radix，按2015年版《中国药典》一部炮制项要求制成饮片。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS T3 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；柱温：30 ℃；流动相：乙腈(A)-质量分数0.5%H3PO4水溶液(B)，洗脱梯度(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→15%A；5～25 min，15%→30%A；25～29 min，30%→80%A)；流速：0.2 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：0.2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 按2015年版《中国药典》炮制要求[1]，除去杂质，稍浸，洗净，润透，切厚片，干燥制得防己饮片。取防己饮片加水煎煮2次，合并煎煮液，减压浓缩，冷冻干燥制得冻干粉，备用。取相当于饮片0.5 g的防己冻干粉，精密称定，置20 mL量瓶中，加入30%(体积分数，下同)乙醇适量使溶解，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)10 min，取出，放冷，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

表1 15个不同产地防己样品信息

Table1Information of Stephaniae Tetrandrae Radix from fifteen origins

编号产地/类型收集时间S1江西省吉安泰和县2016-08S2江西省宜春市樟树县2017-11S3江西省抚州市金溪县2017-10S4江西省抚州市南丰县2017-08S5江西省宜春市高安市2017-11S6江西省景德镇市2017-11S7江西省吉安市泰和县2016-08S8江西省景德镇市2017-11S9江西省景德镇市2017-09S10江西省吉安市遂川县2017-10S11江西省吉安市遂川县2017-10S12江西省吉安市遂川县2017-11S13江西省景德镇市2018-03S14江西省上饶市鄱阳县2018-03S15江西省上饶市鄱阳县2018-03

2.2.2 对照品溶液的制备 取防己诺林碱、粉防己碱、木兰花碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为19.9、300.6、141 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取防己水提物样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各1份，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以11号峰(粉防己碱)为参照峰，测得11个共有峰的相对保留时间的RSD值均小于0.3%，相对峰面积的RSD值均小于2.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取防己水提物样品共6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以11号峰(粉防己碱)为参照峰，测得11个共有峰的相对保留时间的RSD值均小于0.4%，相对峰面积的RSD值均小于4.0%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取防己水提物样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各1份，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，以11号峰(粉防己碱)为参照峰，测得11个共有峰的相对保留时间的RSD值均小于0.6%，相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立与相似度评价

对表1中15个产地的防己水提取物，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，通过比对确定15个防己水提物指纹图谱，见图1。其中，出峰时间基本一致、峰面积相对较大且分离度符合要求的11个色谱峰设为共有特征色谱峰，通过对比对照品与样品指纹图谱中的色谱峰，确定样品特征色谱图中7号峰为木兰花碱，10号峰为防己诺林碱，11号峰为粉防己碱，结果见图2。

1110987654321420400380360340320300280260240220200180160140120100806040200RS15S14S13S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S10246810121416182022242628t/minU/mV

图115个产地防己水提物和参比(R)UPLC指纹图谱

Figure1UPLC fingerprints of 15 batches of Stephaniae Tetrandrae Radix aqueous extracts and their reference fingerprint

7.木兰花碱； 10.防己诺林碱； 11.粉防己碱。

图2混合对照品溶液(A)和防己水提物供试品溶液(B)的UPLC色谱图

Figure2UPLC chromatograms of mixed reference solution(A)and Stephaniae Tetrandrae Radix sample solution (B)

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012 版)对15个防己水提物样品UPLC指纹图谱建立共有模式，作为对照指纹图谱，各批次样品与其比较，进行相似度评价，结果见表2。根据相似度大小，来源于江西省东北部景德镇市和上饶市的6批样品相似度大于0.985，归为I类 ，其余地区批次归为Ⅱ类。

2.5 系统聚类分析

以11个共有特征峰为变量，采用SPSS19.0软件，选择离差平方和法(Ward’s method)为聚类方法、欧氏距离平方法(Squared Euclidean Distance)为测量距离方法进行聚类分析，聚类结果见图3。可见，15个产地防己样品被分为两大类，Ⅰ类包括S6、S8、S9、S13、S14、S15，均来源于景德镇和上饶市；Ⅱ类包括其余批次样品，来源于吉安市、宜春市和抚州市，分类结果与相似度评价结果一致，可区分不同产地防己的来源。

表2 江西15个不同产地防己样品相似度评价结果

Table2Similarity results of Stephaniae Tetrandrae Radix samples from 15 origins in Jiangxi province

编号相似度分类编号相似度分类S10.971ⅡS90.992ⅠS20.962ⅡS100.952ⅡS30.982ⅡS110.977ⅡS40.965ⅡS120.956ⅡS50.978ⅡS130.985ⅠS60.995ⅠS140.991ⅠS70.960ⅡS150.990ⅠS80.996Ⅰ

2.6 主成分分析

以防己水提物11个共有峰峰面积为变量，运用SPSS19.0软件，选择特征值和贡献率为依据进行主成分提取，以根据载荷量计算综合得分，见表3。主成分个数的提取原则为其对应的特征值大于1，故取前4个作为主成分，其累积贡献率达到87.696%，基本可说明各指标的所有信息。特征向量表可知，主成分1主要反映4号、8号、9号和10号(防己诺林碱)色谱峰，主成分2反映5号、6号、7号(木兰花碱)色谱峰，主成分3反映1号和2号色谱峰，主成分4则反映3号和11号(粉防己碱)色谱峰。综合得分排序结果见表4。可见，来源于景德镇市和上饶市的S6、S8、S9、S13、S14、S15共6批防己的综合得分较高，结合相似度与聚类分析结果，推断上述2个地区的防己质量较优。

S13S15S14S8S9S6S1S2S3S7S10S5S11S12S41015202505Ⅰ类Ⅱ类

图315个产地防己水提物聚类分析树状图

Figure3Cluster analysis tree of Stephaniae Tetrandrae Radix samples from 15 origins

表3 主成分特征值及贡献率结果

Table3Eigenvalue and contribution rate of principal component analysis

主成分特征值贡献率/%累计贡献率/%14.32839.34739.34722.11919.26558.61331.75115.91974.53241.44813.16487.696

表4 综合得分排序Table 4 Scores of principal component analysis

3 讨论

2015年版《中国药典》收录的防己含量测定指标成分是粉防己碱和防己诺林碱，本文采用UPLC法建立防己水提物指纹图谱，在法定标准基础上进一步提升江西产区防己药材的质量控制手段。本研究结果显示，15个不同产地防己水提物指纹图谱的相似度较高，均大于0.95，说明主产区内不同产地间的化学组成较一致，可以作为防己药材来源。聚类分析既适用于药材产地区分，也用于不同等级、规格的鉴别；主成分分析则将多指标凝聚成较强的信息作为综合评价指标[7]。本文的主成分分析结果显示，4个主成分累计方差贡献率为87.696%，粉防己碱和防己诺林碱则分布于2个不同主成分内，表明《中国药典》含量测定项下采用的2种成分贡献率有限，而采用指纹图谱更有利于防己的整体质量控制；结合相似度评价和聚类分析显示，景德镇市和上饶市防己药材成分组成和含量一致，综合评价得分高，表明江西东北部此2个产地的药材质量更优，可区分于其他产地药材，为该产区防己的种质、药材来源以及相关制品的质量稳定性提供参考依据。

近年来，有研究报道通过比较防己水提物及其活性单体的毒效关系，发现防己水提物的镇痛效果更优，粉防己碱作为防己的主要组分并不能够完全表征防己的药效；防己水提物停药后的肝脏毒性可逆性是粉防己碱停药后所不具备的，提示其水溶性强、极性大的生物碱类成分起了协同和持续的作用[8-9]。因此，本文通过江西产区防己UPLC指纹图谱的建立与分析，为进一步研究防己有效物质成分奠定了基础。