壳聚糖/纳米银制备抗菌纸及其抗菌效果研究

2019-09-10李志健杨丽红杜于之涵李俊炜

中国造纸 2019年8期

李志健杨丽红杜飞于之涵李俊炜

（陕西科技大学轻工科学与工程学院，陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室，轻化工程国家级实验教学示范中心，陕西西安，710021）

抗菌纸的研究是近年来抗菌材料应用的一个新领域，由于它与人们的工作、生活休戚相关，有很大的实用价值，引起了人们的普遍关注，因此发展十分迅猛，如医疗用纸、新生儿用纸等。单一的抗菌剂往往不能满足抗菌纸的某种要求，抗菌剂的使用向着混合联用的方向发展。

壳聚糖是天然多糖几丁质的脱乙酰产物[1-2]，具有良好的生物相容性和生物降解性，且本身无毒无害，具有抗菌能力，被广泛用于服装、医药卫生、食品包装等领域。由于壳聚糖本身的抗菌能力较弱，因此研究者们对壳聚糖进行物理或化学改性，或者引入外源抗菌因子与壳聚糖混合联用来提高壳聚糖复合材料的抗菌性能[3-6]。Zhang等人[7]将纳米TiO2粉末混入壳聚糖溶液中制成薄膜用于食品包装，来延长食物的保鲜时间。Simin等人[8]将壳聚糖纳米纤维与纤维素纳米纤维复合后制成薄膜涂覆于纸币上来赋予纸币抗菌性能。

纳米银具有杀菌作用，渗透性强且无任何耐药性[9-11]，近年来，银也作为一种功能性材料发展很快。李爽等人[12]综述了将纳米银负载于纤维上制备抗菌纸，纳米银作为光催化氧化的催化剂可以用作造纸废水处理等工业用途。Kofi等人[13]采用一步火焰法将纳米银粒子喷涂于纤维材料上制备抗菌纸。但银作为一种重金属，大量的使用对生产者和使用者均有一定的危害，因此在达到相同抗菌能力的前提下，减少银的使用成为研究的重点。

本实验通过将纳米银和壳聚糖有效混合后使用，使纸张获得协同的抗菌性能，既减少了纳米银的使用量，也改善了单一壳聚糖抗菌性能弱的问题。为了满足抗菌剂在抗菌纸中应用的需求，对两种抗菌剂最佳浓度和添加量进行了研究。

1 实验

1.1 实验原料

阔叶木浆板，江苏UPM公司；壳聚糖，脱乙酰度＞90%，上海展云化工有限公司；营养物质（蛋白胨、氯化钠、牛肉膏、琼脂粉），北京奥博星生物技术有限责任公司；硝酸银（AgNO3），分析纯，天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸钠，分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司；大肠杆菌原液，国家微生物菌种保藏中心。

1.2 实验设备

槽式打浆机（TD8-23，咸阳通达轻工设备有限公司）；标准浆料疏解机（992304，瑞典L＆W）；纸样抄取器（TD10-200，咸阳通达轻工设备有限公司）；手提式压力蒸汽灭菌器（GMSX-280，北京市永光明医疗仪器有限公司）；微生物培养箱（DHP-9031，上海一恒科学仪器有限公司）；激光显微拉曼成像光谱仪（DXRxi，赛默飞世尔科技（中国）分子光谱部）；环境扫描电子显微镜（Q45，美国FEI和EDAX）；电热鼓风干燥箱（DHG-9053A，上海一恒科技有限公司）；电子天平（MC249，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 纳米银抗菌剂的制备

将AgNO3白色晶体分别按0.05mmol/L、0.5mmol/L配成AgNO3溶液，将柠檬酸钠白色粉末与去离子水按质量比1︰99配成质量分数为1%的柠檬酸钠溶液。取100 mL硝酸银溶液置于250 mL圆底烧瓶中，开启电动搅拌器搅拌并打开冷凝回流装置，油浴升温并加热，最终将温度设定为120℃。待溶液开始沸腾后加入2 mL柠檬酸钠溶液继续加热，回流1 h后停止反应，得到纳米银（溶胶）抗菌剂[14-15]。避光常温下保存。

1.3.2 壳聚糖抗菌剂的制备

（1）浆内添加

称取1 g聚乙烯醇（PVA）加入到20 mL去离子水中，加热搅拌至溶化，然后称取2 g壳聚糖加入到PVA溶液中，搅拌均匀，得到壳聚糖抗菌剂。PVA溶液具有一定的胶黏性，在浆内添加抗菌剂的抄纸过程中加入可以防止抗菌剂的流失。

（2）表面涂布

称取2 g壳聚糖加入到500 mL质量分数约0.2%的稀醋酸溶液中，室温下搅拌使其混合均匀。溶解7～8 h后配制成质量分数约为0.4%的壳聚糖溶液。向壳聚糖溶液中滴加质量分数为0.2%的氢氧化钠溶液调节pH值为7.5，此时壳聚糖溶胶从溶液中析出，溶液由澄清透明变为白色乳浊液。取100 mL壳聚糖乳浊液进行抽滤，得到壳聚糖抗菌剂。

1.3.3 壳聚糖/纳米银混合抗菌剂的制备

（1）浆内添加

称取1 g PVA加入到20 mL去离子水中，加热搅拌至溶化，然后称取2 g壳聚糖加入到PVA溶液中，搅拌均匀后滴加纳米银抗菌剂，继续搅拌得到壳聚糖/纳米银混合抗菌剂。

（2）表面涂布

1.3.4 抗菌纸的制备

（1）浆内添加

设置浆料打浆度为50°SR，纸张定量为60 g/m2，制备不同抗菌剂添加量的抗菌纸。实验室纸页成型器的面积为0.0317 m2，抄片的绝干浆质量为2 g，将所得抗菌纸剪切成直径为20 mm的小圆片备用。

控制纸张定量不变，分别抄造添加单一壳聚糖抗菌剂的抗菌纸、添加单一纳米银抗菌剂的抗菌纸、添加壳聚糖/纳米银混合抗菌剂的抗菌纸，添加抗菌剂的配比如表1和表2所示（所用纳米银抗菌剂为0.5 mmol/L）

（2）表面涂布

设置浆料打浆度50°SR，纸张定量为60 g/m2，抄造空白纸（不加抗菌剂）10张。将空白纸裁剪至直径为20 mm的圆纸片备用，圆纸片的绝干浆质量为0.02 g；将圆纸片放置在平整的玻璃板上，用涂布棒进行涂布，待其晾干后，密封遮光保存，备用。

表1 浆内添加单一抗菌剂的配比

表2 浆内添加混合抗菌剂的配比

分别抄造涂布单一壳聚糖抗菌剂的抗菌纸、涂布单一纳米银抗菌剂的抗菌纸、涂布壳聚糖/纳米银混合抗菌剂的抗菌纸。添加抗菌剂的配比如表3和表4所示（所用纳米银抗菌剂为0.05 mmol/L）。

表3 表面涂布单一抗菌剂的配比

表4 表面涂布混合抗菌剂的配比

1.3.5 抗菌实验

（1）制作生物培养基

称取一定量的营养物质放入烧杯中，将烧杯放在万用炉上加热，用玻璃棒搅拌直至溶质溶解，用5 mol/L NaOH（约0.2 mL）调pH值至7.0，用去离子水定容至1 L，分装入三个锥形瓶中，用棉塞塞住并用报纸包住瓶口，与所用的平板培养皿、镊子、玻璃棒、接种环一起在121℃高压灭菌20 min。灭菌后开始倒平板，冷却至50℃左右，将培养基迅速倒入无菌平板培养皿中，每个培养皿倒入约2/3的培养基，盖上培养皿盖后，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平放在操作台上，待琼脂凝固后即制得平板，操作过程均为无菌环境。培养基成分如表5所示。

表5 培养基成分

（2）接种大肠杆菌进行抗菌实验

用灭菌后的接种环，将大肠杆菌均匀接种于凝固的培养基上，然后将抗菌纸放置于培养基表面，将培养基放置于微生物培养箱，在温度30℃、湿度90%环境下培养48 h后观察，并将抗菌实验后所得抑菌环直径从不同角度测量3次，取其平均值，进行分析。

1.3.6 抗菌纸抗菌机理的研究

（1）环境扫描电子显微镜（ESEM）分析

在温度30℃、湿度90%的微生物培养箱中进行48 h抑菌环实验，选取培养皿中距抑菌环最远处的大肠杆菌和相同培养皿中抑菌环边缘大肠杆菌，制作ESEM样本。用接种针分别将所选大肠杆菌从培养基中取下直径为1.5 mm的菌落，在200 μL的生理盐水中稀释，充分分散后，吸取1滴在铝箔纸上，将铝箔纸放入30℃烘箱内干燥后，用导电胶将其粘贴在载物片上进行观察。

（2）激光显微拉曼成像光谱分析

选取与ESEM制样同组样品的大肠杆菌进行制样，用接种针分别将所选大肠杆菌从培养基中取下直径为1.5 mm的菌落，放入200 μL生理盐水中稀释，离心15 min，吸取上清液后再次加水离心，重复3次，避免大肠杆菌悬液中培养基的干扰。振荡均匀后，吸取1滴于铝箔纸上，放入30℃烘箱内干燥，将其用双面胶固定于载物片上进行观察。

激光显微拉曼成像光谱仪的测试条件：激光器的激发波长532 nm；激光功率水平10 mW。特征拉曼光谱图数据[16-17]如表6所示。

表6 特征拉曼光谱图数据

（3）抗菌性能检测

采用抑菌环实验[18-19]对所得抗菌纸进行抗菌性能检测。

2 结果与讨论

2.1 抗菌实验结果分析

2.1.1 抗菌剂用量对抗菌纸抗菌性能的影响

选取表1和表3所示壳聚糖抗菌剂配比进行分析。

图1为不同壳聚糖添加量抗菌纸的抗菌效果图。从图1可以看出，抗菌纸的抗菌性能与壳聚糖的添加量成正比，随着壳聚糖添加量的增加，抑菌环直径增大，抗菌纸的抗菌性能增强。图2为壳聚糖添加量对抗菌纸抑菌环直径的影响。从图2可以看出，随着壳聚糖添加量的增加，抑菌环直径不断增大，当壳聚糖添加量为7.5%时，抑菌环直径变化不大，抗菌纸所体现出的抗菌性能变化趋于平缓，为了保证抗菌纸有良好的抗菌效果和抗菌稳定性，选取10.0%为壳聚糖最佳添加量。

2.1.2 抗菌剂添加方式对抗菌纸抗菌性能的影响

选取壳聚糖添加量10.0%和纳米银溶胶添加量0.54%时不同添加方式的样本进行分析。

抗菌剂添加方式对抗菌纸抗菌性能的影响如图3、图4所示。从图3可以看出，浆内添加与表面涂布两种方式所得抗菌纸的抑菌环实验均有抑菌环出现，而且抗菌纸远处的大肠杆菌生长良好；从图4可以看出，在抗菌剂添加量相对于绝干浆质量相同时，表面涂布所得抗菌纸抑菌环的直径均大于浆内添加抗菌剂所得抗菌纸。混合添加时，其中浆内添加混合抗菌剂的抑菌环直径为23.9 cm，表面涂布混合抗菌剂的抑菌环直径为25.1 cm，表面涂布抑菌环的直径相较于浆内添加增大4.8%。

2.2 抗菌剂对大肠杆菌的抗菌机理分析

2.2.1 抑菌环远处大肠杆菌结果分析

图5所示为ESEM的结果。由图5可以看出，大肠杆菌呈椭圆形的枕头状，形状饱满，并且其尺寸大小均一，分布密集。

激光显微拉曼成像光谱测试结果如图6所示。从图6(a)可以看出，大肠杆菌维持着完整的细胞结构，核膜结构完整。图6(b)结果显示，拉曼位移在858 cm－1的吸收为酪氨酸吸收峰，在1308 cm－1处的吸收为酰胺Ⅲ、β-回折、腺嘌呤吸收峰，在1442 cm－1处的吸收峰为脱氧核糖吸收峰，在1667 cm－1处的吸收为胸腺嘧啶，C＝＝O伸缩振动，酰胺Ⅰ吸收峰。拉曼成像结果表明，大肠杆菌的核膜结构完整。ESEM与激光显微拉曼成像光谱测试结果均说明抑菌环远处的大肠杆菌并未受到抗菌剂的影响。

图1 不同壳聚糖添加量抗菌纸的抗菌效果图

图2 壳聚糖添加量对抗菌纸抑菌环直径的影响

图3 抗菌剂不同添加方式所得抗菌纸的抗菌效果

图4 抗菌剂的添加方式对抗菌纸抑菌环直径的影响

图5 抑菌环远处大肠杆菌的ESEM图像

图6 抑菌环远处大肠杆菌拉曼光谱图

2.2.2 抑菌环边缘大肠杆菌结果分析

抑菌环边缘大肠杆菌的ESEM图像如图7所示。从图7可以看出，与图5相比，其中部分细菌的形态已经发生了变化。出现了偏圆形和细长杆状的大肠杆菌，大肠杆菌形态的大小不一，形状皱瘪，不饱满，细菌分布的密集程度较低并且很多细菌已经出现粘连现象。

图7 抑菌环边缘大肠杆菌的ESEM图像

激光显微拉曼成像光谱仪测试结果如图8所示。从图8(a)可以看出，抑菌环边缘大肠杆菌未显示出完整的细胞结构，且有物质流出；图8(b)为整个大肠杆菌拉曼光谱图，其中代表细胞膜的位置未出峰，表明大肠杆菌的细胞膜已经破裂，此外还出现了新的特征峰；在541 cm－1处的吸收为二硫键的色氨酸吸收峰，并且二硫键有反式-扭曲反式构象；图8(c)和图8(d)表示细胞的流出物；图8(d)所示在541 cm－1处的吸收为色氨酸吸收峰，在1442 cm－1处的吸收为脱氧核糖吸收峰，即代表大肠杆菌拟核结构破碎，说明在抑菌环边缘的大肠杆菌核膜结构已经破裂，不能维持细胞原有状态。

ESEM与激光显微拉曼光谱结果均验证了抑菌环边缘大肠杆菌中部分细菌的形态已发生了变化。抗菌剂不仅阻碍大肠杆菌的生长，而且会使细菌的核膜结构受损，细菌不能维持正常的生长发育，从而死亡。