雷公藤多苷片改善肾病综合征大鼠代谢紊乱的谱效关系研究

曹 艳，徐亚洁，运乃茹

(天津中医药大学第二附属医院，天津 300250)

肾病综合征主要是由肾小球病变所致的一组临床证候群，其典型表现为各种代谢紊乱，如大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症。雷公藤多苷是从卫矛科植物雷公藤的去皮根中提取精制的有效部位混合物，对肾病综合征、类风湿性关节炎、红斑狼疮等难治性或顽固性疾病疗效独特，有“中草药激素”之称[1]。其见效快、疗效确切，几乎没有可以完全替代的中药，但自雷公藤多苷投入临床以来，不良反应事件频繁报道[2,3]。分析原因，一方面是缺乏统一的质量控制方法，另一方面雷公藤多苷的部分有效成分也有一定的毒性。因此，本文在建立雷公藤多苷片HPLC指纹图谱的基础上，结合体外改善代谢紊乱的药理实验研究，采用偏最小二乘法(partial least-squares regression，PLS)分析二者的相关性，为全面评价雷公藤多苷的质量提供依据，也为雷公藤多苷深层次的药效-毒性研究奠定基础。

1 材料

1.1药品与试剂 雷公藤多苷片购自市售药店，批号及生产厂家见表1；雷公藤甲素、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤红素(批号依次为140424、130925、130823、130420、130925、130325)对照品均购自成都思天德生物科技有限公司；注射用盐酸阿霉素(批号H33021979)购自浙江海正药业股份有限公司；蛋白定量测试盒、总胆固醇测试盒、甘油三酯测试盒、白蛋白测试盒均购自南京建成生物工程研究所；乙腈为色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 雷公藤多苷片生产厂家及批号

1.2仪器与设备 Agilent1200高效液相色谱仪；KQ-400KDE数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler Toledo XS205DV电子天平(瑞士Mettler Toledo)；3K15型冷冻高速离心机(美国Sigma公司)。

1.3实验动物 SD大鼠80只，雄性，体重(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，使用许可证号SYXK(津)2014-0002，饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，饮用水经自动制水机制得。

2 方法与结果

2.1雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱 根据文献报道[4]，将雷公藤多苷片超声提取后，过中性氧化铝柱进行纯化，制备供试品溶液。采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长为218 nm，柱温为35 ℃，流速为0.75 ml/min，以水(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～15 min，10%→35% B；15～22 min，35% B；22～30 min，35%→55% B；30～35 min，55% B；35～40 min，55%→60% B；40～70 min，60%→85% B；70～75 min，85%→95% B；75～80 min，95%→10% B)，建立了6批雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件处理，生成对照指纹图谱，确定了22个共有特征峰，见图1。对指纹图谱的特征峰进行指认，确定10、12、22号峰分别为雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤内酯甲。

图1 6批雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱叠加图

2.2雷公藤多苷片改善肾病综合征大鼠代谢紊乱的研究 SD大鼠随机分为8组，分别为正常组、模型组和给药组1～6，每组10只，于实验开始后第4日，模型组和给药组尾静脉一次性注射盐酸阿霉素6.5 mg/kg建立动物模型；于第12日给药组1～6分别灌胃生产厂家为A～F的雷公藤多苷片，剂量为30 mg/kg，正常组及模型组灌胃等体积的生理盐水，1次/d[5]。各组大鼠于灌胃4周末，用代谢笼收集24 h尿液，并于收集尿液结束当天，全部大鼠乙醚吸入麻醉，心脏穿刺采血，室温下2 h内离心，取血清，-20 ℃冰箱保存待测[5]。采用试剂盒测定各项血、尿生化指标，包括24 h尿蛋白、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清白蛋白(Alb)，结果见表2。

表2 雷公藤多苷片对实验大鼠各项生化指标的影响

与模型组比较，*P<0.05

2.3谱效关系研究 以标准化处理的指纹图谱中各共有峰峰面积为X，各项生化指标值为Y，采用偏最小二乘法进行相关分析，拟合出指纹图谱中各共有峰峰面积与各项生化指标值之间的回归方程，其中回归系数反映了各X对Y的贡献大小，PLS回归系数的绝对值越大，说明该共有色谱峰对改善该指标的贡献就越大。各X对应Y的回归系数见表3。

由表3可知，共有峰对24 h尿蛋白的贡献率大小依次为:X9>X20>X1>X7>X3>X6>X11>X14>X15>X16>X10>X19>X8>X17>X13>X21>X2>X5>X22>X18>X4>X12，指纹图谱中1、2、4、6、11、14、15、17、19、20、21和22号峰与24 h尿蛋白水平呈负相关；共有峰对血清白蛋白的贡献率大小依次为:X9>X10>X7>X3>X8>X13>X20>X16>X14>X1>X5>X15>X11>X6>X19>X4>X17>X21>X2>X22>X18>X12，指纹图谱中6、11、14、15、17、18、19、20、21和22号峰与血清白蛋白水平呈正相关；共有峰对总胆固醇的贡献率大小依次为:X9>X10>X14>X6>X20>X7>X1>X19>X15>X17>X11>X21>X13>X3>X22>X2>X4>X8>X16>X5>X18>X12，指纹图谱中1、2、4、5、6、11、14、15、17、18、19、20、21和22号峰与总胆固醇水平呈负相关；共有峰对甘油三酯的贡献率大小依次为:X1>X14>X13>X16>X6>X10>X5>X4>X9>X11>X8>X3>X18>X15>X2>X20>X19>X22>X7>X21>X17>X12，指纹图谱中1、2、3、4、5、6、8、14、17、19、20和22号峰与甘油三酯水平呈负相关。综合来看，推测6、14、17、19、20、22号峰是减少24 h尿蛋白、改善低蛋白血症和高脂血症的主要色谱峰；另外，1、2和4号峰对应的极性较大的物质，对24 h尿蛋白的减少和高脂血症的改善也有一定促进作用。

表3 雷公藤多苷片共有峰的标准回归系数

3 讨论

雷公藤多苷片在《中国药典》(2015版)中未收录，在《卫生部药品标准中药成方制剂》(第十七册)中有收录，其含量测定是采用薄层扫描法测定雷公藤内酯甲的含量。本研究的HPLC指纹图谱中，22号峰为雷公藤内酯甲，6批雷公藤多苷片的22号峰峰面积大小依次为：B>D>C>A>E>F，若以雷公藤内酯甲作为质控指标，6个生产厂家的雷公藤多苷片的质量依次为：B>D>C>A>E>F。

中药谱效关系研究中的数据分析方法有灰色关联度分析、双变量相关分析、多元线性回归、偏最小二乘回归、典型相关分析等。偏最小二乘回归分析综合了多元回归分析、典型相关分析和主成分分析，且对于自变量间存在多重相关性以及样本数量少于自变量数量时尤为适用[6,7]。本研究采用偏最小二乘法对指纹图谱共有峰峰面积和24 h尿蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血清白蛋白进行分析，结果表明6、14、17、19、20和22号色谱峰可能是雷公藤多苷片中减少24 h尿蛋白、改善高脂血症和低蛋白血症的主要色谱峰，由于仅指认出改善代谢紊乱的色谱峰，而其具体成分均未进行定性和定量研究，因此雷公藤多苷片改善代谢紊乱的谱效关系还有待进一步的深入研究和完善。