花生FAD2基因家族表达分析及其对低温胁迫的响应

薛晓梦 李建国 白冬梅 晏立英 万丽云 康彦平 淮东欣,* 雷 永 廖伯寿,*

花生基因家族表达分析及其对低温胁迫的响应

薛晓梦1李建国1白冬梅2晏立英1万丽云1康彦平1淮东欣1,*雷 永1廖伯寿1,*

1中国农业科学院油料作物研究所/ 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室, 湖北武汉 430062;2山西省农业科学院经济作物研究所, 山西汾阳 032200

为了探究在花生低温响应中的作用, 本研究从普通油酸花生中花16 (ZH16)和高油酸花生中花413 (ZH413)中克隆得到花生家族的全部基因, 共7个。通过分析这些基因的表达模式发现, 在ZH16和ZH413中各基因表达模式相似,主要在花和发育的种子中表达,主要在营养组织中表达,主要在根和花中表达, 表明基因在花生不同发育阶段和不同组织中发挥各自的生物学功能。在15℃下发芽6 d发现, ZH413的发芽率未显著下降, 而ZH16的发芽率显著下降。种子萌发过程中,和均受低温诱导表达。在ZH16中在低温诱导第6天开始显著上调表达, 而在ZH413中第1天显著上调表达; 在ZH16中在低温诱导第3天出现显著上调表达, 之后表达量下降, 但在ZH413中第1天就显著上调表达, 且始终维持在高水平表达。基于以上研究结果推测, 高油酸花生在受到低温胁迫时,编码蛋白失活, 但的高量表达在一定程度上弥补了这部分功能。同时也说明功能的缺失并不是决定花生耐寒性的主要因素。本研究的开展为培育抗寒的高油酸花生品种奠定了理论基础, 为高油酸花生在高纬度、高海拔地区推广提供了理论支持。

脂肪酸脱氢酶(FAD2); 基因克隆; 低温胁迫; 基因表达

花生(L)是世界范围内主要的油料作物之一, 集中分布在热带、亚热带以及温带地区[1]。我国是主要的花生生产国, 目前种植面积达到近500万公顷, 占全球的20%。我国花生总产的一半左右用于榨油, 是世界上最大的花生消费国[2-3]。

花生的脂肪酸组成对其营养价值、食用品质、存储和加工性能以及市场价值等方面起着决定性作用。油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)是花生脂肪酸的主要成分, 其总和约占80%, 高油酸花生中油酸含量达到75%以上[4]。油酸能选择性地降低人体血液中有害的低密度胆固醇, 而保持有益的高密度胆固醇, 可有效预防心血管疾病的发生, 而且高油酸花生抗氧化能力强、货架期长, 因此受到广大消费者和花生加工企业的青睐。

在高油酸花生推广的过程中发现, 高油酸品种在低温条件下出苗率低, 特别在东北地区播种遭遇低温时常烂种, 高油酸品种表现不耐低温[5]。花生高油酸性状是由2对Δ12脂肪酸脱氢酶(,)基因隐性突变导致的[6]。已有研究报道, 拟南芥()突变体植株在低温条件下生长缓慢, 植株矮小, 耐低温能力显著低于野生型拟南芥[7-8]。酵母()的基因在低温处理2 h后转录水平上调, 之后其表达量回复到日常水平[9]。棉花()的和在低温处理下表达量显著提高, 而和的表达不受温度影响[10]。花生具有多个家族基因, 它们在不同组织中的表达量不尽相同[11]。对于花生中的家族基因与花生耐寒性的关系鲜有报道。研究花生基因在低温胁迫条件下的响应水平, 对解析高油酸花生的耐寒性具有重要意义。

本研究从栽培种花生中克隆得到7个基因, 并通过荧光定量PCR (qRT-PCR)探究其在高油酸花生(ZH413)和普通油酸花生(ZH16)各组织器官中的表达模式, 通过比较ZH413和ZH16在低温胁迫条件下的发芽率、各基因在低温下的表达模式来分析花生基因与其耐低温能力的相关性, 将为解析和改良高油酸花生的耐寒性提供理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通油酸花生中花16 (ZH16)油酸含量为54.3%, 高油酸花生中花413 (ZH413)油酸含量为78.8%, 均为珍珠豆型花生。种植试验在中国农业科学院油料作物研究所试验基地(武昌)进行, 于2017年5月初播种, 8月底收获。

1.2 试剂与测序分析

大肠杆菌感受态10、pEASY-Blunt Cloning Kit、聚合酶、RNA抽提试剂盒均购自全式金生物科技有限公司; SYBR荧光PCR染料、反转录试剂盒等均购自诺唯赞生物科技有限公司; PCR引物的合成和测序由武汉擎科生物科技有限公司协助完成。

1.3 总RNA的提取及cDNA的合成

花生播种后6 d, 分别收集ZH16和ZH413的胚根、胚轴、子叶和真叶; 60 d后分别收集ZH16和ZH413的根、茎、新叶、老叶、花以及未入土的果针; 100 d后分别收集ZH16和ZH413发育的种子, 并根据其种子形态划分为5个时期。将所有收集到的样品液氮速冻后, 存于-80℃备用。

取100 mg左右的样品置液氮冷却的研钵中, 加入液氮迅速研磨成粉, 按照RNA提取试剂盒的方法提取总RNA。通过分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量, 取1 μg的DNA-free RNA根据反转录试剂盒提供的方法和将其反转为cDNA。

1.4 FAD2家族基因的克隆和测序分析

利用已知的花生基因(KF741365和KF741366)编码的氨基酸序列, 在花生基因组信息(http://www.peanutbase. org/)中进行blast分析, 得到花生中所有基因序列信息, 并根据核苷酸序列设计引物(表1)。分别以ZH16和ZH413发育种子的cDNA为模板, 克隆得到所有基因, 送公司测序。利用Copmuter PI/MW (https://web.expasy.org/protparam/)预测FAD2蛋白质的等电点及相对分子质量。

表1 克隆AhFAD2基因使用的引物及其序列

1.5 FAD2家族基因的表达模式分析

通过在线工具Integrated DNA Technologies (http://sg. idtdna.com/scitools/Applications/RealtimePCR/)设计基因的荧光定量PCR引物(表2)。

以ZH16和ZH413不同生长时期各组织的cDNA为模板, 按照TaKaRa荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex说明书进行PCR, 反应体系为20 μL, 包含SYBR Premix Ex(2×) 10 μL、引物(F/R)各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。反应程序为95℃变性3 min; 95℃变性30 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 测荧光值, 40个循环; 最后计算溶解曲线以0.1℃ s-1的速度从60℃升至90℃。设每个反应3个重复, 利用2–DDCt法计算基因的相对表达量。利用Graph Pad Prism 5软件和Microsoft Excel软件处理和分析实验数据。

1.6 低温胁迫试验

分别挑选50粒ZH16和ZH413的饱满种子, 置培养皿中充分吸胀后, 分别置15℃和25℃培养箱中, 分别在1、3、6 d统计的发芽种子, 并选取5粒有代表性的种子提取其总RNA, 并反转得到cDNA。以上试验重复3次。

发芽率(%) = 发芽的种子数/参试种子总数×100

利用上述设计的家族基因荧光定量PCR引物,按照翊圣荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex说明书进行qRT-PCR。

2 结果与分析

2.1 花生AhFAD2家族基因的克隆

利用已知的花生基因(KF741365和KF741366)编码的氨基酸序列, 在花生基因组信息网站(https://www. pea­n­ut­­base.org/)中进行blast分析, 共得到7个基因。分别以ZH16和ZH413发育种子的cDNA为模板, 克隆测序得到这些基因ORF的序列信息, 并根据它们在花生基因组中的位置和同源性分别命名为、、、、、和(表3),为1对同源基因, 分别位于A09和B09染色体上, 均编码379个氨基酸, 相对分子质量为43.65 kDa, pI为8.9;中第451位的G突变为T, 形成终止密码子, 导致翻译提前终止;为1对同源基因, 分别位于A06和B06染色体上, 分别编码349个和383个氨基酸, 相对分子质量分别为39.7 kDa和43.8 kDa, PI分别为8.85和8.80;一对同源基因, 分别位于A09和B09染色体上, 均编码387个氨基酸, 相对分子质量为45.0 kDa, pI分别为8.94和9.04。

表2 Real time PCR引物及其碱基序列

表3 花生FAD2家族基因信息

2.2 花生AhFAD2基因的表达分析

利用荧光定量PCR分析各基因在高油酸花生ZH413和普通油酸ZH16的15个组织中的表达模式(图1)表明,主要在花生发育种子中表达,在ZH16的花中也高量表达, 但该基因在ZH413中表达量较低。在种子发育的各个时期, ZH16中表达量均高于ZH413。的表达模式与类似, 虽然在花生的各组织均有表达, 但表达量都很低。在花生的各组织均有表达,但主要在叶片和茎中表达, 而在种子中的表达量相对较低。在ZH16幼嫩叶片和果针中的表达量比在ZH413中高, 而在ZH413花和发育早期的种子中的表达量比在ZH16中高。主要在根和花中高量表达, 在花中的表达量最高, 是根中表达量的1000倍左右。在ZH16和ZH413各组织中的表达量没有显著差异。通过比较、和在花生种子发育各时期的表达量发现,在ZH16和ZH413的种子发育中后期表达量最高。在ZH16和ZH413种子发育各时期均有表达, 且在ZH413的种子发育初期表达量最高。而在ZH16和ZH413种子发育各时期表达量都很低。以上结果表明, 花生各基因的表达模式不尽相同, 其可能在不同发育阶段、不同组织中发挥作用, 例如是花生种子中决定油酸含量的关键基因, 而在营养组织中的表达量较高, 可能是调控花生营养组织中不饱和脂肪酸含量的主要基因。

(图1)

A: 本研究中涉及到的15个花生组织。I: 播种6 d后的胚根; II: 播种6 d后的胚轴; III: 播种6 d后的子叶; IV: 播种6 d后的真叶; V: 播种60 d后的根; VI: 播种60 d后的果针; VII: 播种60 d后的茎; VIII: 播种60 d后的幼嫩叶片; IX: 播种60 d后的成熟叶片; X: 播种60 d后的花; XI: 白色、扁平的发育中的种子; XII: 白色、水滴形的发育中的种子; XIII: 白色、鱼雷形的发育中的种子; XIV: 浅粉色、圆形的发育中的种子; XV: 深粉色、成熟的种子。B:基因在15个花生组织中的表达水平。白色表示普通油酸材料ZH16; 灰色表示高油酸材料ZH413。经单因素方差分析差异达到显著水平。*< 0.05; **< 0.01; ***< 0.001。C:基因在花生发育种子中的表达分析。标有不同小写字母的柱值表示经单因素方差分析和最小显著差异法(LSD)检验差异达到显著水平(< 0.05)。

A: 15 peanut tissues involved in this study. I: radicle after 6 days of sowing; II: hypocotyl after 6 days of sowing; III: cotyledon after 6 days of sowing; IV: true leaves after 6 days of sowing; V: root after 60 days of sowing; VI: peg after 60 days of sowing; VII: stem after 60 days of sowing; VIII: yong leaves after 60 days of sowing; IX: mature leaves after 60 days of sowing; X: flowers after 60 days of sowing; XI: white and flat developing seeds; XII: white and drop-shaped developing seeds; XIII: white and torpedo-shaped developing seeds; XIV: light pink and round developing seeds; XV: dark pink and mature seeds. B: expression analysis ofgenes in 15 tissues of peanut. The white column indicates normal oleate peanut ZH16, the gray column indicates high oleate peanut ZH413. Differences reached a significant level by one-way analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001. C: expression analysis ofgenes in developing seeds. Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05 by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

2.3 低温处理对ZH16和ZH413发芽率的影响

在25℃和15℃温度处理下, 分别统计ZH16和ZH413种子的发芽率(表4)。25℃条件下, 种子浸泡24 h后即可露白; 而在15℃条件下, 种子的萌发时间显著延长, 种子在3 d后开始露白。在25℃条件下, ZH16的种子发芽率为91.33%, ZH413的种子发芽率为94.66%, 差异不显著; 而在15℃条件下, ZH16的种子发芽率为45.00%, ZH413的种子发芽率为98.67%, ZH16的发芽率显著低于ZH413 (表4和图2)。以上结果表明, 虽然低温均延长了ZH16和ZH413的萌发时间, 但是ZH413在低温处理6 d后发芽率仍然达到90%以上, 而ZH16在低温处理下发芽率显著降低。因此, 高油酸花生的耐寒性并不一定比普通油酸花生差。

2.4 低温胁迫对AhFAD2基因在高油酸和普通油酸花生中表达模式的影响

为了调查基因在低温胁迫条件下是否参与了花生的低温响应过程, 利用荧光定量PCR分析了不同温度处理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413萌发种子中各基因的表达模式(图3)。研究发现, 在25℃条件下, ZH16和ZH413中随着处理时间的延长, 其表达量逐渐增加(图3-a, d)。而在15℃条件下, ZH16中前3 d的表达量与25℃处理条件下的表达量差异不显著; 在处理第6天,在15℃条件下的表达量比在25℃条件下的表达量显著提高(图3-a)。处理第1天, ZH413中在15℃条件下的表达量比在25℃条件下的表达量显著上调20倍以上, 但在第3天后其表达量显著下调, 比在25℃条件下的表达量显著下调10倍以上(图3-d), 表明是受低温诱导表达的基因, 在ZH16中响应较慢, 但在ZH413中响应非常快。

表4 不同温度处理条件下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的种子发芽率

标以不同小写字母的值表示经单因素方差分析和最小显著差异法(LSD)检验差异达到显著水平(< 0.05)。

Values followed by different lowercase letters are significantly different at< 0.05 are determined by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

图2 不同温度处理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的种子发芽情况

图3 在不同温度处理下各AhFAD2基因在ZH16和ZH413中的表达分析

a: 在不同温度处理下,在ZH16中的表达模式; b: 在不同温度处理下,在ZH16中的表达模式; c: 在不同温度处理下,在ZH16中的表达模式; d: 在不同温度处理下,在ZH413中的表达模式; e: 在不同温度处理下,在ZH413中的表达模式; f: 在不同温度处理下,在ZH413中的表达模式。经单因素方差分析差异达到显著水平, *< 0.05; **< 0.01; ***< 0.001。

a: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; b: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; c: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; d: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions; e: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions; f: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions. Significant differences are determined by one-way analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

在25℃条件下, ZH16和ZH413中表达量均随着时间的延长而逐渐减少(图3-b, e)。在15℃条件下, ZH16中的表达量显著下调, 且始终比其在25℃条件下的表达量低(图3-b); 而ZH413中的表达量与其在25℃条件下的表达量差异不显著(图3-e)。

在25℃条件下, ZH16中不同时间点的表达量变化不显著(图3-c); 而ZH413中在6 d后表达量显著上调(图3-f)。在15℃条件下, ZH16中的表达量第3天出现显著上调, 在第6天时又显著下调(图3-c); 而ZH413中的表达量从第1天就显著上调, 且在处理的6 d中表达量一直维持在高水平, 虽然呈现下降趋势, 但始终比其在25℃条件下的表达量高20倍以上(图3-f)。以上结果表明,受低温诱导表达, 在ZH16中其表达量呈先上升后下降的趋势, 而在ZH413中始终维持在高水平表达, 呈微弱下降趋势。

综合以上结果得出, 在低温胁迫种子萌发过程中,和均受低温诱导表达, 而在高油酸材料中和的响应速度都比在普通油酸材料中快, 表达量上调的倍数也比在普通油酸材料中多, 特别是基因在高油酸材料受到低温胁迫时始终维持在高水平表达, 推测其高水平的表达部分弥补了突变的的功能。

3 讨论

花生属于温带和亚热带作物, 整个生育期需要足够的光照强度和合适的温度条件, 温度是限制花生种植分布的重要因素。低温会造成花生烂种增多、发芽率降低、出苗迟缓, 致使基本苗减少, 生育期延长, 最终导致减产。已有研究表明, 细胞中多不饱和脂肪酸的含量与植物的抗寒能力具有一定相关性, 多不饱和脂肪酸含量越高, 抗寒性越强[12-16]。脂肪酸脱氢酶是生物体内调控不饱和脂肪酸合成的关键酶, 细胞中脂肪酸脱氢酶的种类和数量是决定植物抗寒性的重要因素[17-19]。本研究系统分析了花生FAD2家族全部基因, 并调查了这些基因在花生15个组织中的表达模式, 以及它们在受到低温胁迫时表达模式的变化。

基因是一个含有多个成员的基因家族, 甘蓝型油菜中含有4个基因[20], 红花()中含有11个基因[21]。本研究从栽培种花生中共克隆到7个基因, 其中6个成对出现, 分布在A、B亚基因组的相应位置, 仅基因没有找到A亚基因组相对应的拷贝。基因的第451位碱基G突变为T, 形成终止密码子, 导致翻译提前终止, 翻译的蛋白不具有功能。阮建等[11]研究发现花生家族中含有6个基因, 与本研究结果基本一致, 但本研究克隆得到在A06染色体上的同源基因。

已有大量研究报道,和是与高油酸花生形成相关的基因[22-25], 通过表达模式分析发现, 相较于其他基因,在发育种子中的表达量最高, 因此基因是花生种子中最重要的基因。这也解释了为什么花生中存在6个有功能的基因, 仅和发生突变就可以使花生种子中油酸含量从40%提高到80%。

在花生发育种子中的表达量排第二, 但其在营养组织中的表达量更高。在花生发育种子中的表达量极低, 但是在根和花中的表达量很高。以上结果表明, 花生的基因具有表达的组织偏好性, 以此实现不同基因在花生生长发育过程中的分工。在其他植物中也发现了类似现象, 红花中11个基因也具有表达的组织特异性,和主要在花和发育的种子中表达,在各个组织中都表达, 而和主要在根中特异表达[21]。

和均在受到低温胁迫后上调表达, 特别是在高油酸花生中,和的响应速度和上调倍数均比在普通油酸材料中快且多。在其他植物中也发现基因受低温诱导表达。橄榄中的在橄榄冷驯化的过程中参与冷胁迫响应, 转录活性提高, 提高种子中亚油酸含量, 促进角质的形成, 从而保护胚乳[26]。棉花中的和受到低温胁迫后, 转录水平显著上调[10]。唐桂英等[27]通过低温处理花生幼苗叶片发现,(对应本研究中的)受低温胁迫诱导表达。但本研究中在受到低温胁迫后没有表现出转录水平的变化, 可能由于处理的样品是萌发种子, 也许它更多参与花生苗期或中后期的调控。大豆中在营养生长组织和发育的种子中均有表达, 但在受到冷胁迫刺激时, 转录水平并无明显差异[28]。

高油酸花生中基因发生突变, 引起种子中甘油三酯的脂肪酸组成变化, 即在大幅提高油酸含量的同时也大幅降低亚油酸的含量[29]。但是这种变化可能不局限于甘油三酯, 种子膜脂中亚油酸含量也有可能大幅降低[30-31]。而细胞膜中, 多不饱和脂肪酸(比如亚油酸、亚麻酸)含量越高, 越有利于细胞膜的流动性[32]。当低温胁迫时, 细胞膜流动性下降, 黏度增加, 运输功能下降, 严重时细胞膜从常态的液晶相转变为凝胶相, 膜的结构改变, 透性增大, 最终致细胞死亡[33]。基因主要在发育的种子中表达, 而在种子发育的过程中, 高油酸花生中合成的亚油酸总量可能比普通油酸花生中的总量少, 也有可能造成高油酸花生的细胞膜中亚油酸含量偏低, 即高油酸花生种子细胞膜流动性可能比普通油酸花生的差。因此, 当高油酸花生和普通油酸花生在萌发时遭遇低温胁迫, 有可能因为种子发育过程中造成的膜脂中亚油酸含量的差异, 从而影响萌发过程中的细胞膜流动性, 最终表现为发芽率的差异。本研究通过比较高油酸花生ZH413和普通油酸花生ZH16在低温处理下的发芽率发现, ZH413的发芽率并没有显著下降, 而ZH16发芽率显著下降, 说明在影响花生耐寒性的诸多因素中,功能的缺失并不是决定其耐寒性的主要因素。主要在种子中表达, 其功能的缺失并不会影响花生营养器官的生长发育, 而主要在营养器官中发挥作用, 高油酸花生中该基因并没有发生突变, 理论上不会影响其营养器官的耐寒性。在萌发的种子中, 虽然高油酸花生中丧失了功能, 但在受到低温胁迫时持续显著上调表达, 也部分弥补了缺失的功能, 及时合成亚油酸, 从而维持细胞膜的流动性, 保障了高油酸花生的耐寒性。因此, 高油酸花生的耐寒性是否一定比普通油酸花生差, 这一论断仍然有待继续深入研究。本研究结果为高油酸在高纬度、高海拔地区的普及提供了可能性, 通过筛选耐寒性较强的高油酸品种可以实现其在高纬度、高海拔地区的种植。

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Expression profiles ofgenes and their responses to cold stress in peanut

XUE Xiao-Meng1, LI Jian-Guo1, BAI Dong-Mei2, YAN Li-Ying1, WAN Li-Yun1, KANG Yan-Ping1, HUAI Dong-Xin1,*, LEI Yong1, and LIAO Bo-Shou1,*

1Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China;2Industrial Crops Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Fenyang 032200, Shanxi, China

To explore the roles ofin response to cold stress in peanut, we cloned sevengenes from normal oleate peanut ZH16 and high oleate peanut ZH413, respectively. The results of qRT-PCR showed that the expression patterns ofgenes were similar in ZH16 and ZH413.was highly expressed in flower and developing seed,was mainly expressed in leaf and stem, andwas expressed specifically in root and flower, indicating thatgenes played their respective roles in different developmental stages and tissues of peanut. At 6 days after inducing under 15℃, the germination rate of ZH16 was significantly decreased while that of ZH413 was not significantly affected. The expression of bothandwere induced by cold stress. The expression ofwas significantly up-regulated at 6 DAI in ZH16, while at 1 DAI in ZH413, suggesting thatwas induced by cold more quickly in high oleate peanut. Furthermore, the expression ofwas significantly up-regulated at 3 DAI in ZH16 and then decreased, while it was increased immediately and maintained at high level for six days in ZH413. Based on these results, we speculate thatup-regulation ofmay compensate the function ofthat is deactivated under cold stress in high oleate peanut, and the deactivation ofis not the most important factors affecting peanut cold tolerance. This study provides a theoretical basis in breeding of high oleate peanut with high tolerance to cold stress, and the theoretical support for extension of high oleate peanut in both high latitude and high altitude regions.

fatty acid desaturase 2 (FAD2); gene cloning; cold stress; expression profile

本研究由湖北省自然科学基金项目(2017CFB161), 国家自然科学基金项目(31671734, 31871662)和国家重点研发计划项目(2018YFD1000901)资助。

This study was supported by the Hubei Provincial Natural Science Foundation of China (2017CFB161), the National Natural Science Foundation of China (31671734, 31871662), and the National Key R&D Program of China (2018YFD1000901).

淮东欣, E-mail: dxhuai@caas.cn; 廖伯寿, E-mail: lboshou@hotmail.com

E-mail: xiaomengxue1991@163.com

2018-12-27;

2019-05-12;

2019-06-13.

10.3724/SP.J.1006.2019.84177

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190612.0858.002.html