降糖袋泡茶总多糖的含量测定研究

2019-09-10任凌燕

福建茶叶 2019年4期

任凌燕，陈楠，徐刚

（1.重庆科技学院安全工程学院，重庆 401331；2.工业发酵微生物重庆市重点实验室，重庆 401331）

目前，糖尿病严重威胁着人类的健康。2017年国际糖尿病联盟公布目前全球共有4.25亿成人糖尿病患者，中国成人糖尿病患者人数高达1.14亿，位居世界第一，占总数的1/4以上[1]。而中国糖尿病的患病率2013年达到10.9%，仅次于美国（13%）[2]。随着人们对中草药多糖研究的深入，利用其开发制作安全经济、具有降血糖保健功能的天然食品引起广大学者的持续关注。

袋泡茶因其具有冲泡快速方便、清洁卫生、用量标准的特点，可横跨茶饮料、保健品、药茶三大行业。其中以茶为原料，传统中草药为主要成分的保健袋泡茶正适应了现代人们快节奏生活工作和保健养生的需要。降糖袋泡茶以绿茶为基础，与生黄芪、玉米须、萆薢、知母、荷叶、桑叶、葛根等多味中草药混合组成，在临床应用中发现其对糖尿病患者日常控制血糖具有良好效果。我们通过前期药理研究已发现，该降糖袋泡茶对实验性糖尿病大鼠具有明显的降糖作用[3]。据相关文献报道，其袋泡茶中黄芪多糖[4]、玉米须多糖[5]、知母多糖[6]、桑叶多糖[7]、葛根多糖[8]、绿茶茶多糖[9]等均具有不同程度的降血糖作用。因此，研究降糖袋泡茶总多糖含量水平的高低，可为降糖袋泡茶的后续开发和质量控制提高一定的参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 仪器：紫外分光光度计（UV-1100上海美谱达仪器有限公司）、13S223S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限责任公司）、HH-6数显恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）等。

1.1.2 实验试剂与材料：降糖袋泡茶（生黄芪、玉米须、荷叶、葛根等中药饮片购自重庆桐君阁饮片有限责任公司，打粉后于绿茶混合自制成袋泡茶）；D-无水葡萄糖标准品（中国药品生物制品鉴定所，110833-201707）。

1.2 方法和结果

1.2.1 标准溶液的配制及标准曲线的绘制：精密称取105℃干燥至恒重D-无水葡萄糖100mg置于100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得1.000mg/ml的葡萄糖溶液。精密移取此溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置于 100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/ml的葡萄糖标准品溶液。分别精密量取2.0ml各浓度的葡萄糖标准溶液至15ml具塞试管中，沿着各试管壁缓慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸试剂，摇匀后盖紧振摇，沸水浴中加热10min，取出流水冷却30min，另取2.0ml蒸馏水，加蒽酮-硫酸试剂，同上操作作为空白对照，在620nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 蒽酮-硫酸试剂的配制：称取蒽酮0.2 g，缓慢加入100ml浓硫酸，边加边搅拌至黄色透明液，避光保存在棕色瓶中，现用现配，如有结晶析出，可稍加热溶解。

1.2.3 样品溶液的制备及测定：精密称取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g置于250ml圆底烧瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，过滤，残渣用80%乙醇-蒸馏水洗涤3次，收集残渣挥干，用30ml蒸馏水每次回流1小时，回流2次，过滤，残渣用蒸馏水洗涤3次，滤液置于250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，再取20.0ml至100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，作为降糖袋泡茶总多糖样品溶液。

精密量取样品溶液2.0ml至15ml具塞试管中，照“1.2.1”项标准曲线绘制的方法操作，依法测定吸光度，采用标准曲线法计算样品中多糖的含量。

1.2.4 检测波长的选择：精密移取标准葡萄糖溶液2.0ml至15ml具塞试管中，沿着各试管壁缓慢加入5.0ml冷的蒽酮-硫酸试剂，摇匀后盖紧振摇，沸水浴中加热10min，取出流水冷却30min，同上操作作为空白对照，在400-800nm的波长范围内扫描。另精密移取样品溶液2.0ml，按相同方法显色后在400-800nm的波长范围内扫描。同时按相同方法配置不显色的样品溶液，在相同波长范围内扫描，结果标准葡萄品溶液和样品溶液经显色后在波长620±1nm处均有最大吸收，未显色的样品溶液几乎无吸收。因此，选择620nm为降糖袋泡茶总多糖的测定波长。

1.2.5 标准曲线及线性范围：分别精密量取2.0ml各浓度的葡萄糖标准溶液至15ml具塞试管中，按“1.2.1”项标准曲线绘制的方法绘制标准曲线。Y=14.234x-0.0044，相关系数为0.9991，葡萄糖在0.01-0.08mg/ml浓度范围内线性关系良好。

1.2.6 精密度试验：精密吸取葡萄糖对照品溶液2.0ml，按“1.2.1”项下方法，在620nm处测定吸光度，连续测定5次，并计算RSD。实验结果见表1，RSD为0.11%，说明该方法精密度好。

表1 精密度试验结果

1.2.7 重复性试验：在同一样品溶液中分别移取2.0ml，平行5份，按“1.2.1”项下方法，在620nm处测定吸光度，求RSD。实验结果见表2，RSD为0.13%，说明该方法具有良好的重现性。

表2 重复性试验结果

1.2.8 稳定性试验：移取同一供试品溶液2.0ml，按“1.2.1”项下方法，分别在室温下放置 30、60、90、120、150min 时，在 620nm处测定吸光度（n=5），并计算RSD。实验结果见表3，RSD为0.58%，由此可见，溶液在显色冷却后150min内稳定性好。

表3 稳定性试验结果

1.2.9 加标回收率试验：精密称取已知浓度为61.01mg/g的样品粉末1.0g，共5份，分别放入250ml圆底烧瓶中，精密加入无水葡萄糖对照品10.1mg，按“1.2.3”项方法制备样品溶液，然后按“1.2.1”项下方法测定吸光度，计算回收率以及RSD值。实验结果见表4，回收率平均值为98.19%，RSD=3.30%。

表4 加标回收率试验结果

1.2.10 样品的测定：精密称取降糖袋泡茶样品粉末约1.0g，共5份，按“1.2.3”项方法制备样品溶液和测定。实验结果如表5，降糖袋泡茶中多糖的平均含量为6.08%。

表5 降糖袋泡茶中多糖含量测定结果

2 讨论

2.1 样品处理条件的选择

2.1.1 样品回流时间的确定：精密称取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流60min，过滤，残渣用80%乙醇-蒸馏水洗涤3次，收集残渣挥干。三份样品用蒸馏水分别回流30min、60min和90min。回流完毕，用250ml容量瓶定容，分别取20ml再定容成100ml。然后按“1.2.1”项下方法，在620nm处测定吸光度值。结果见表6，显示回流60min时，多糖提取基本完全。

表6 不同回流时间下样品溶液的吸光度值

2.1.2 样品回流溶剂量的确定：精密称取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇-水20mL回流提取60min，过滤，残渣用80%乙醇-蒸馏水洗涤3次，收集残渣挥干。三份样品分别加20、30、40ml的蒸馏水当溶剂，回流60min后，抽滤，用蒸馏水洗涤滤渣3次后，分别将溶液定容成 250ml，取 20.0ml再定容成 100ml，然后按“1.2.1”项下方法，在620nm处测定吸光度。实验结果见表7，显示提取溶剂量为30ml时多糖提取基本完全。

表7 不同溶剂量下样品溶液的吸光度值

2.1.3 样品回流提取次数的选择：精密称取干燥至恒重的降糖袋泡茶原料1.0g三份置于250ml圆底烧瓶中，加入80%乙醇-水20ml回流60min，过滤，残渣用80%乙醇-蒸馏水洗涤3次，收集残渣挥干。残渣分别用30ml蒸馏水每次回流60min，三份样品分别回流1次、2次、3次。回流完抽滤，用蒸馏水洗涤滤渣后，用250ml容量瓶定容，取20.0ml再定容成100ml，然后按“1.2.1”项下方法，在620nm处测定吸光度。实验结果见表8，显示回流提取2次时多糖提取基本完全。

表8 不同提取次数下样品溶液的吸光度值

2.2 测定条件的选择

2.2.1 反应温度的确定：精密移取对照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸试剂，按“1.2.1”项下方法，分别选择在 40℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴锅中加热10min，随行作空白，然后在620nm处测定吸光度。实验结果见图1，当反应温度为100℃时，测定的吸光度值最大，因此显色反应最佳温度为100℃。

2.2.2 反应时间的确定：精密吸取对照品溶液2.0ml，加入蒽酮-硫酸试剂，按“1.2.1”项下方法，在沸水浴中加热，加热时间分别为 5、8、10、15、20min，随行作空白，然后在 620nm 处测定吸光度。由实验结果图2，当反应时间选择10min时测得的吸光度值最大，因此显色反应的时间确定为10min。