几种植物多糖的结构特征与预防肥胖活性研究

刘海燕 任发政 李景明 侯彩云

摘 要：目的：探究白茶多糖（white tea polysaccharide，WTP）、枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）、桑叶多糖（mulberry leaf polysaccharide，MLP）结构与预防高脂饮食小鼠肥胖活性的关系。方法：对多糖理化成分、分子质量、单糖组成、紫外以及红外光谱进行分析;通过高脂饲料喂养同时配合灌胃处理构造小鼠预防肥胖模型，以Orlistat为对照，研究预防肥胖活性，q PCR测定小鼠肝脏中脂质代谢相关基因表达水平，同时测定血清转氨酶水平。结果：WTP、LBP、MLP重均分子质量分别为18 180、22 410、34 430U;紫外及红外光谱显示，3种植物多糖为半乳糖吡喃环蛋白缀合物，在预防肥胖方面具有明显优势，可将高脂饮食引起的体重增长分别降低26.63%、13.05%、11.52%，且WTP、LBP优于Orlistat。3种植物多糖均能降低脂肪湿重，WTP、LBP均能降低脂肪细胞直径，但MLP对于脂肪细胞直径的降低效果并不明显。三者均上调脂质分解基因的表达，下调脂质合成基因的表达，脂质代谢紊乱状态得到有效改善。结论：本实验剂量下，WTP、LBP、MLP均具有良好的预防肥胖功效，且WTP预防肥胖效果优于LBP和MLP。WTP对于高脂饮食引起的脂肪肝具有良好的预防效果。

关键词：白茶多糖;结构;预防肥胖;安全性

寻求和开发天然减肥替代品具有重要意义[1-2]。研究显示[3]，茶叶具有预防肥胖功效且安全性更高，除功能因子茶多酚具有降脂减肥功效外[4]，茶多糖也具有该功效。茶多糖多为与蛋白质结合的酸性糖蛋白[5]，且对于茶多糖的研究集中于乌龙茶、红茶、绿茶等，WTP研究较少。本研究通过建立高脂饮食小鼠肥胖模型，以具有一定调节脂质代谢作用的LBP[6]、MLP[7]作为对比，对肥胖小鼠脂质代谢相关指标进行研究，并探究其结构与预防肥胖活性的关系，为WTP预防肥胖功效研究进一步提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WTP、LBP、MLP，陕西慈缘生物技术有限公司，同一加工工艺提取;异丙醇、氯仿、无水乙醇（分析纯），北京化工;Trizol试剂，碧云天生物科技有限公司;DEPC水，北京索莱宝科技有限公司;反转录试剂盒（5X All-In-One RT Master）、实时荧光定量试剂盒（Eva Green 2X q PCR Master Mix-No Dye），美国abm公司;小鼠引物，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白检测仪、Biometra T-personal梯度PCR仪、Roche lightcycler 96荧光定量PCR仪、Wyatt Technology DAWN EOS多角度激光光散射仪、TU-1810紫外可見分光光度计、Nikon Eclipse Ci光学显微镜、DIONEX ICS-3000 USA、PerkinElmer Spectrum 100傅里叶变换红外光谱仪等。

1.3 方法

1.3.1 理化指标测定 采用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量[8]、福林酚法测定多酚总量[9]、考马斯亮蓝试剂盒法测定蛋白质含量。

1.3.2 分子质量测定 采用尺寸排除色谱和多角度激光光散射仪联用装置（SEC-MALLS）测定样品的绝对重均分子质量。选用Shodex OHpak SB-806MHQ（8 mmol/L×300 mmol/L）色谱柱，示差折光检测器检测。多角度激光光散射仪波长为658.0nm，柱温25℃，流动相为0.1mol/L氯化钠+叠氮化钠的水溶液，洗脱流速为0.5mL/min，进样量为200μL，样品溶液浓度为1mg/mL，用0.2μm滤膜过滤。用Mn=40 000U的葡聚糖标准品作为对照。

1.3.3 单糖组成测定 称取茶多糖10 mg于水解管中，加入三氟乙酸（4 mol/L，4 mL），充氮1 min排出管内空气，旋紧螺旋盖，水解（120℃，2 h），待冷却后氮气吹干水解液，除去过量的三氟乙酸，加超纯水定容至10 mL。稀释后，0.2 μm滤膜过滤，准备进样。单糖标准品采用同样方法处理后准备进样。

离子色谱条件：采用Carbo PacTMPA20 3×150mmol/L Analytical分析柱，淋洗液为250mmol/L NaOH，流速0.5mL/min，进样体积10μL，柱温35℃，检测器：脉冲安培检测器，金电极。

木糖及甘露糖梯度洗脱条件：A为水，B为250mmol/L的NaOH，0～20min，99% A，1% B;20～20.1 min，20% A，80% B;20.1～30 min，20% A，80 % B;30.1～40 min，99% A，1% B。

其他单糖与糖醛酸梯度洗脱条件：A为水，B为250 mmol/L的NaOH，C为1 mol/L的NaAC，0～20 min，94% A，6% B，0% C;20～20.1 min，89% A，6% B，5% C;20.1～35 min，74% A，6 % B，20% C;35.1～45 min，20% A，80% B;45.1～55min，94% A，6% B。

1.3.4 UV及IR测定 UV测定：称取多糖样品各3.0 mg，用蒸馏水配制成一定质量浓度的溶液，在200～400 nm波长范围内进行全扫描。IR测定：称取多糖样品各2.0 mg，加入适量KBr混合、压片，用Nicolet 380傅里叶变换红外光谱仪在4 000cm-1～400cm-1区间扫描，记录红外光谱。

1.3.5 实验动物分组与饲养

（1）实验动物与饲料：8 w SPF级雄性C57BL/6J小鼠（17±1）g，许可证号SCXK（京）2016-0002，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司;小鼠高脂营养饲料H10060及小鼠繁殖饲料许可证号SCXK（京）2014-0008，北京华阜康生物科技股份有限公司。

（2）动物实验：小鼠于屏障系统适应性喂养7 d后，按照体重随机分为6组：正常对照组（NC）、模型对照组（MC）、阳性对照组（PC）、WTP干预组、LBP干预组、MLP干预组6组。繁殖饲料喂养NC组，高脂饲料10060喂养其余各组小鼠，以最终MC组体重均值显著性高于NC组为造模成功。造模同时配合灌胃处理，以0.2 mL/10g的灌胃量[10]，等体积蒸馏水灌胃NC组和MC组，50 mg/kg·BW灌胃PC组小鼠，300 mg/kg BW灌胃多糖组小鼠，实验时间8w。

（3）剂量设置：多糖干预组参照已有研究[11]，制定小鼠灌胃剂量为300 mg/kg·BW[12]。PC组选用药物Orlistat（奥利司他，赛尼可，Roche Pharman （Schweiz）Ltd），参照已有研究[13]并进行合理调整（在郑丽等[3]研究基础上增加1倍量，最终确定为50 mg/kg· BW。

1.3.6 样品采集和检测

（1）常规指标检测：每周记录体重变化，实验结束后，准确称量皮下、肾周、附睾脂肪重量并计算总脂肪湿重。（2）组织病理学观察：断颈处死后，剖取小鼠肝脏和脂肪组织，置于4%多聚甲醛溶液，固定48h，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片（4 μm厚），HE染色，显微镜观察切片组织病理学特征，于200倍视野下，使用Image-Pro Plus 6.0软件，统计皮下脂肪细胞直径。（3）血清学指标检测：8 w实验结束，将所有小鼠禁食12 h，摘眼球采血处死。血样经过离心处理（5 000 r/min、4℃、15 min），分离血清样本，全自动生化分析仪测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平。（4）q PCR检测：Trizol试剂抽提小鼠肝脏RNA[14]，反转录制备c DNA第一链，采用10μL体系进行荧光定量，EvaGreen 2X q PCR MasterMix-No Dye 5μL，cDNA模板1μL，上游引物（10 nmol/L）0.3μL，下游引物（10 nmol/L）0.3μL，ddH2O补充至10μL。按照梯度程序：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s，循环45次。以 GAPDH 为内参基因，采用2-（ΔΔCT）法[15]对各基因的表达水平进行分析（表2）。

1.4 数据分析

采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析，以均值±标准误差（±SE）表示;组间均值比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。图像采用Origin 8.5软件处理。

2 结果与分析

2.1 多糖主要成分

由表3可知，WTP、LBP、MLP 多糖含量均在75%～80%之间;多酚含量均在1% 以内，蛋白质含量均在3.5%以内。多糖的含量在茶叶提取物组分中处于优势地位，可认为多糖主要发挥生物活性。

2.2 分子质量测定

由图1可知，3种植物多糖峰形较宽，均含有杂峰，且LBP、MLP均非单一对称峰，说明三者为分子质量不均一杂多糖;由计算方法得出，WTP、LBP、MLP重均分子质量分别为18 180、22 410、34 430U，呈现WTP<LBP<MLP的规律，推测植物种类导致三者分子质量的差异。同时推测分子质量越小，越容易进入细胞膜发挥生物活性，WTP有可能具有预防肥胖生物活性优势。

2.3 单糖组成

根据色谱各峰保留时间对应各单糖标准品可知，WTP、MLP均含9种单糖，LBP未检出岩藻糖，由其余8种单糖组成。如表4所示，在阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸物质的量百分比占比方面表现出来的规律为：WTP>MLP>LBP，在甘露糖方面呈现出相反规律;在岩藻糖、葡萄糖醛酸方面表现出来的规律为：MLP>WTP>LBP;在葡萄糖方面表现出来的规律为：LBP>MLP>WTP。整体来看，WTP在单糖种类和物质的量百分比占比方面具有明显优势。

邬澄飞等[16]认为，单糖组成中单糖种类和半乳糖比例的增加有利于短链脂肪酸的形成，而短链脂肪酸能促进肠道动力、增加肠黏膜屏障、减少脂肪吸收。阿拉伯糖可以增加饱腹感，选择性抑制肠道内蔗糖酶的活性，减少蔗糖吸收量，达到减肥的功效[17]。而木糖、鼠李糖具有调节肠道菌群、润肠通便、排出脂肪的作用[18]。3种多糖中阿拉伯糖、木糖、鼠李糖所占物质的量百分比之和分别为36%、0.5%、8.78%。推测WTP在促进肠胃蠕动、调节肠道菌群、排出脂肪等方面具有优势。

2.4 UV和IR光谱结果

由图2A可知，在200～400nm内，随着波长的增加，3种多糖吸光度整体呈下降趋势。在270～280nm处有较宽吸收峰，为蛋白质吸收峰;260nm处为无核酸吸收峰，且LBP在275nm处吸光度较低，说明蛋白质含量较低。UV测定结果显示，本实验样品为不含核酸的糖蛋白缀合物。从图2B可以看出，在4 000 cm-1～400 cm-1内，样品均具有多糖特征的一般吸收峰：在3 400 cm-1处为O-H的伸缩振动吸收峰，是典型的-COOH峰型，形宽且钝，說明羟基不是游离的，而是在分子间发生了缔合[19-20];在2 936cm-1～2 933 cm-1处为烷烃C-H的伸缩振动吸收峰[19];在1 600cm-1处的宽带与吸收的水相关[20]，表明其对水分子具有较强的亲和力;在1 400 cm-1处为C-H的变角振动，与C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收[21];在1 075cm-1处为主链上的半乳糖吡喃环的伸缩振动[20];在3 400、2 900、1 400、1 075 cm-1附近存在糖类典型特征吸收峰，表明3种样品均为多糖提取物。但是，3种多糖存在差异性：WTP、MLP在3 750cm-1附近为O-H、N-H伸缩振动[22]，而LBP不存在;WTP、LBP在1 025 cm-1附近存在侧链阿拉伯呋喃环，而MLP不存在。整体来看，WTP 在吸收峰类型和数目上优势十分明显，推测其具有较强的生物活性。

2.5 小鼠体重和脂肪湿重变化结果

开始阶段，各组小鼠体重无显著差异（P>0.05），边灌胃边构建动物模型过程中，MC组小鼠出现体重明显增加的症状。图3A显示，8 w实验结束时，MC组小鼠体重极显著高于NC组小鼠体重（P<0.01），成功建立预防肥胖模型[23];WTP、LBP、MLP、PC组体重较MC组分别降低26.63%、13.05%、11.52%、17.49%。可见预防肥胖效果为WTP>LBP>MLP，且WTP组效果明显优于PC组。

为进一步验证高脂饮食对脂肪组织的作用，计算小鼠脂肪湿重，并对小鼠皮下脂肪组织进行病理学切片观察。脂肪湿重统计结果如图3B所示，MC组极显著高于NC组（P<0.01），说明高脂饮食可极显著升高小鼠的脂肪湿重，WTP、LBP、MLP、PC组脂肪湿重较MC组分别降低46.31%、15.16%、3.28%、4.51%。可见预防肥胖效果为WTP>LBP>MLP，且WTP、LBP组效果优于PC组。

由图4可见，NC组脂肪细胞大小均匀，排列紧密，形态正常。MC、PC组脂肪细胞大小不一，绝大多数细胞出现充脂，直径偏大，出现不同程度的分化，黑色箭头显示其出现胞质断裂;WTP组脂肪细胞未见异常;LBP组脂肪细胞排列疏松，少量脂肪细胞胞质断裂，MLP组脂肪细胞排列紧密，少量脂肪细胞胞质断裂，皮下脂肪细胞直径统计结果显示（图3C），较MC组，WTP、LBP组皮下细胞直径分别降低27.96%、2.11%，MLP组脂肪细胞直径不降反增，增加34.19%，WTP组能明显降低脂肪细胞直径，且优于PC组。H&E染色结果显示，本实验剂量下WTP能抑制脂肪组织中的脂肪积累和脂肪细胞分化，从而有效预防高脂饮食小鼠肥胖的发生，LBP次之，而MLP基本不具有抑制脂肪细胞分化的功效。

2.6 对小鼠血脂水平的影响

由表5可知，在TG水平，NC、MC、PC组无显著差异（P>0.05），推测高脂饮食所构建的肥胖模型下，小鼠体内合成TC较TG容易，表现出LBP>WTP>MLP效果;TC水平，3种多糖基本不具有降低该水平的作用;LDL-C水平，表现出WTP>LBP>MLP效果;HDL-C水平，表现出MLP>WTP>LBP效果。PC组在降血脂方面基本不具有优势，而3种多糖在血脂方面各有优势，推测和植物种类密切相关。

2.7 安全性指标评价

由表6可知，ALT水平，MC组与NC组无显著性差异;AST水平，MC组显著高于NC组，但ALT增长赶不上AST，说明小鼠所患非急性肝炎[24-25]。其中，WTP、MLP组基本无肝损伤现象发生，PC、LBP组肝损伤严重。同时AST最大活跃部位为心脏，提示患病小鼠有心肌梗塞风险[26]。故预防高脂饮食引起的肝损伤效果为：WTP>MLP>LBP，WTP在该水平具有突出优势。

2.8 肝脏组织切片情况

图5肝组织切片证实了以上观点，NC、WTP、MLP组切片视野中肝索清晰，肝细胞排列紧密，肝细胞形态正常;MC组和PC组视野中肝细胞界限模糊，可见数量不等的微小圆形脂肪空泡，黑色箭头所示;LBP组肝细胞界限不清晰，胞质肿胀，大部分轻度脂肪变性，视野中可见部分圆形脂肪空泡，与上述小鼠AST、ALT水平研究结果一致。预防高脂饮食引起的肝损伤效果为：WTP>MLP>LBP，WTP在预防慢性肝脏炎症方面具有突出优势。而慢性炎症与癌症密切相关，王刚等[27]研究显示，白茶具有良好的抗突变和体外抗癌的功效，本实验在该研究的基础上进行了肝脏组织切片及肝脏转氨酶方面的解释，推测WTP可能具有预防肝癌的功效。

2.9 q PCR水平

为探究所选植物多糖预防肥胖及脂肪肝发生的机制，本实验对小鼠肝脏脂代谢相关基因的相对表达进行定量。脂肪酸合成关键酶Fas和ACC1上调会促进脂肪酸合成和脂肪积累[28]。由图6A～B可知，MC组这两种基因的相对表达量均极显著高于NC组（P<0.01），药物和多糖组均下调了该基因的表达。较MC组，WTP分别下调了36.88%、40.59%，LBP分别下调了18.13%、21.76%，MLP分别下调了8.13%、7.65%。植物多糖组下调基因量均优于PC组。

脂肪酸氧化限速酶CPT-1催化长链脂肪酸为短链脂肪酸，进入线粒体内部进行β氧化。肝脏CPT-1表达水平下降可导致长链脂肪酸β氧化发生障碍，最终导致大量脂质堆积[29-30]，与之相反，肝脏CPT-1表达量上升可促使脂肪堆积及分泌显著降低[31]。由图6C可知，较NC组，MC组下调了该基因的表达，但未达到显著性（P>0.05）。较MC组，WTP、LBP、MLP基因表达量分别上调了169.23%、117.95%、66.67%。

IL-6为炎症因子，MC组显著高于NC组（P<0.05），说明高脂饮食造成了肝脏的慢性炎症，WTP、MLP组该基因表达量下降了23.08%、4.62%，相反，LBP组该基因表达量增加了36.92%。IL-6表达量同肝脏转氨酶及肝脏组织病理学情况一致，表现出WTP预防脂肪肝效果优于MLP的特点，LBP基本不具有预防脂肪肝的效果。

3 结论

分子质量方面，呈现出WTP

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Abstract：Objective To investigate the relationship between the structure of white tea polysaccharide，Lycium barbarum polysaccharide and mulberry polysaccharide and anti-obesity in mice fed with high-fat diet.Method The physical and chemical components，molecular mass，monosaccharide composition，ultraviolet and infrared spectra of three polysaccharides were analyzed.The mice were prevented from obesity by feeding with high-fat diet and gavage treatment.Orlistat was used as a control to study the prevention of obesity.q PCR was used to determine the expression level of lipid metabolism-related genes in mouse liver，and serum transaminase levels were also determined.Result The average molecular masses of WTP，LBP，MLP were 18 180，22 410 and 34 430 U，respectively.Ultraviolet and infrared spectra showed that the three plant polysaccharides were galactose pyranine conjugates.The three plant polysaccharides had obvious advantages in anti-obesity，which can reduce the body weight growth caused by high-fat diet by 26.63%，13.05% and 11.52%，respectively，and WTP and LBP were better than Orlistat.All the three plant polysaccharides could reduce the fat weight quality.Both white tea polysaccharide and Lycium barbarum polysaccharide could reduce the diameter of fat cells，but the effect of MLP on the reduction of fat cell diameter was not obvious.All of them up-regulated the expression of lipid-degrading genes，down-regulated the expression of lipid-synthesis genes，and the disordered state of lipid metabolism was effectively improved.Conclusion Under the dose of this experiment，WTP，LBP，MLP have good anti-obesity effect，and the anti-obesity effect of WTP is better than the other two.WTP has a good anti-obesity effect on fatty liver caused by high fat diet.

Keywords：white tea polysaccharides;structure;anti-obesity;safety

（責任编辑 李婷婷）