白藜芦醇-羟丙基-β-环糊精-壳聚糖缓释微球的制备及表征

张纯刚 于琛琛 周旖璇 尹丽 程岚 康廷国 韩岚

中图分类号 R943 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）17-2322-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.04

摘 要 目的：制备白藜芦醇（RES）-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）-壳聚糖缓释微球（RES-HP-β-CD-Chitosan），并进行表征。方法：按质量比1 ∶  7 ∶ 0.25称取RES原料药、HP-β-CD和壳聚糖，先采用溶剂法制备RES-HP-β-CD包合物，在此基础上加入壳聚糖，采用喷雾干燥法制得RES-HP-β-CD-Chitosan。采用光学显微镜观察所制缓释微球的粒径。采用X射线衍射法、差式扫描量热法、红外光谱法、扫描电子显微镜对所制RES-HP-β-CD-Chitosan进行表征。采用紫外分光光度法测定所制缓释微球中RES的含量，计算载药量和包封率。结果：所制RES-HP-β-CD-Chitosan的粒径为（2.23±0.35） μm（n=300），表征结果显示，RES-HP-β-CD-Chitosan呈球形，微球表面出现收缩褶皱，RES被包合于羟丙基-β-环糊精中，以分子状态或无定型状态存在。RES-HP-β-CD-Chitosan的载药量为11.67%（n=3）、包封率为96.27%（n=3）。结论：成功制得RES-HP-β-CD-Chitosan。

关键词 白藜芦醇;羟丙基-β-环糊精;壳聚糖;制备;表征

Preparation and Quality Evaluation of Resveratrol-Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin-Chitosan Sustained- release Pellets

ZHANG Chungang1，YU Chenchen1，ZHOU Yixuan1，YIN Li1，CHENG Lan1，KANG Tingguo1，HAN Lan2（1.School of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Dalian 116620， China;2.School of Pharmacy， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230012， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To prepare Resveratrol-hydroxypropyl-β-cyclodextrin-chitosan sustained-release pellets （RES-HP-β- CD-Chitosan）， and to characterize it. METHODS： Resveratrol raw material， HP-β-cyclodextrin and chitosan were collected with ratio of 1 ∶ 7 ∶ 0.25. Resveratrol-HP-β-cyclodextrin inclusion compound were prepared by solvent method， and then added into chitosan， RES-HP-β-CD-Chitosan were prepared by spray drying method. Particle size of prepared sustained-released pellets were observed by optical microscope. X-ray， DSC， IR and SEM were used to characterize RES-HP-β-CD-Chitosan. The contents of resveratrol in prepared sustained-released pellets were determined by UV spectrum， and drug-loading amount and encapsulation efficiency were calculated. RESULTS： Particle size of prepared RES-HP-β-CD-Chitosan was （2.23±0.35） μm （n=300）. Characterization results show that RES-HP-β-CD-Chitosan was spherical in shape; shrinkage was found on the surface of microspheres， and resveratrol was included in HP-β-cyclodextrin in molecule or amorphous state. Drug-loading amount of prepared RES-HP-β-CD-Chitosan was 11.67% （n=3）， encapsulation efficiency was 96.27% （n=3）. CONCLUSIONS： RES-HP-β-CD- Chitosan is prepared successfully.

KEYWORDS   Resveratrol; Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Chitosan; Preparation; Characterization

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）属于非黄酮类多酚化合物，具有顺、反两种异构体，其反式异构体的生物活性更强[1]，其主要存在于虎杖、花生、葡萄、桑椹等植物中，药理作用广泛，包括抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保护等，具有巨大的开发研究价值[2-6]。但是由于RES的水溶性差[7]，且具有光敏性[8]，及对酸碱度敏感[9]，同时在体内代谢迅速[10]，致使口服生物利用度不足1%[11]，严重影响其临床应用。

环糊精是一类重要的高分子材料，通过与药物形成包合物结构而实现提高难溶性药物溶解性、增强药物稳定性、改善药物生物利用度等目的[12]。经改性后的羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）与天然的β-环糊精相比，HP-β-CD水溶性大幅度提高，并具有更高的安全性[13]。壳聚糖是自然界存在的一种碱性氨基多糖，具有生物相容性和生物黏附性，可以延长药物在体内的滞留时间和释放时间，增加机体对药物的吸收[14]。

为了提高RES的溶解性，本文采用溶剂法制备RES-HP-β-CD包合物（RES-HP-β-CD），在此基础上加入壳聚糖，制备成RES-HP-β-CD-壳聚糖缓释微球（RES-HP-β-CD-Chitosan），并对所制缓释微球进行质量评价，以期为RES新制剂的开发及应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

FA1004 精密电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）;LC-2010A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）;UV1600紫外分光光度计（上海美普达仪器有限公司）;Bioq-8000喷雾干燥仪[汇和堂生物工程设备（上海）有限公司];BA300光学显微镜（加拿大Motic公司）;JSM-7800F扫描电子显微镜（日本Jeol公司）;ESCALAB 250X射线衍射仪（美国Thermo Fisher Scientific     公司）;FTIR-850紅外光谱仪（天津港东科技股份有限公司）。

1.2 药品与试剂

RES原料药（武汉远成共创科技有限公司，批号：20171225，纯度：98%）;RES对照品（南京森贝伽生物科技有限公司，批号：111535-201502，纯度：98%）;HP-β-CD（山东滨州智源生物科技有限公司，批号：20171201）;壳聚糖（潍坊海之源生物制品有限公司，批号：160815A）;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 缓释微球的制备

2.1.1 RES-HP-β-CD的制备 精密称取RES原料药与HP-β-CD，质量比为1 ∶ 7，先将HP-β-CD溶于适量乙醇中，然后将RES原料药加入其中，搅拌下使之溶解，并在室温下挥干乙醇，即得RES-HP-β-CD。

2.1.2 RES-HP-β-CD-Chitosan的制备 精密称取壳聚糖溶于1% 醋酸中，将RES-HP-β-CD分散加入到上述溶液中，搅拌，采用喷雾干燥法制备RES-HP-β-CD-Chitosan，其中RES/HP-β-CD/壳聚糖的质量比为1 ∶ 7 ∶ 0.25。喷雾干燥工艺参数：进口温度130 ℃，出口温度75 ℃，进料速度5 mL/min，雾化气流速8.8 L/min。

2.2 表征

2.2.1 粒径 采用的BA300光学显微镜直接观察RES-HP-β-CD-Chitosan的粒径，记录大约300粒缓释微球的直径，通过计算平均值得到缓释微球的粒径。结果，RES-HP-β-CD-Chitosan的粒径为（2.23±0.35） μm（n=300）。

2.2.2 X射线衍射法 使用ESCALAB 250 X射线衍射仪分别对RES原料药、HP-β-CD、壳聚糖、RES-HP- β-CD及其处方量的物理混合物、RES-HP-β-CD-Chitosan及其处方量的物理混合物进行扫描，2 θ范围为4°～60°。X射线衍射分析图见图1。

由图1显示，RES为典型的晶体化合物，其在4°～60°范围内存在明显的晶体衍射峰，而HP-β-CD、壳聚糖在此范围内无衍射峰，为无定形化合物。在两个物理混合物中，RES的晶体衍射峰明显，说明RES以晶体的形式存在。而在RES-HP-β-CD和RES-HP-β- CD-Chitosan中，并未发现RES的晶体衍射峰，提示RES被包合于HP-β-CD中。

2.2.3 差示扫描量热法 采用差示扫描量热法分别对RES原料药、HP-β-CD、壳聚糖、RES-HP-β-CD及其处方量的物理混合物、RES-HP-β-CD-Chitosan及其处方量的物理混合物进行检测，置于铝制坩埚中，以空坩埚作为参考池，升温速度为10 ℃/min，扫描范围为30～300 ℃。差示扫描量热分析图见图2。

由图2显示，RES玻璃转化温度（Tg）为181 ℃[1]，在272 ℃出现其药物熔点峰;其余样品在90 ℃左右均出现一宽峰，这可能是由于样品中所含的水分蒸发所致的吸热峰;HP-β-CD和壳聚糖以无定形形态存在，未显示熔融吸热峰;两个物理混合物中均存在一个熔融吸热峰，说明其中的RES仍以晶体存在，其峰形较宽、较钝，且温度较RES原料药的熔点低，这可能是由于温度高于Tg，药物处于高弹态，药物分子的热运动速率增加，使部分药物分子进入HP-β-CD空腔，部分药物分子与HP-β-CD外部的羟丙基形成氢键紧密连接，从而对药物的熔点存在抑制。RES-HP-β-CD和RES-HP-β-CD-Chitosan中均未出现RES的熔点峰，说明其中的RES以分子状态或无定型状态存在。

2.2.4 红外光谱法 使用红外光谱仪分别对RES原料药、HP-β-CD、壳聚糖、RES与HP-β-CD 物理混合物、RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan及其处方量的物理混合物进行扫描，通过溴化钾（KBr）压片的方法，在  4 000～400 cm-1的条件范围内进行检测。红外光谱分析图见图3。

由图3显示，RES的特征峰有3 305 cm-1、1 515 cm-1和1 380 cm-1（酚苯环）、964 cm-1、827 cm-1和678 cm-1。HP-β-CD 的特征峰有3 448 cm-1、2 937 cm-1、1 654 cm-1、1 049 cm-1以及757 cm-1、850 cm-1、935 cm-1（葡萄糖环特征吸收峰）。壳聚糖的特征峰是—OH与N—H因氢键作用而致伸缩振动吸收峰重叠形成的，其波长为3 480 cm-1。在两个物理混合物的红外光谱中仍存在RES的酚苯环特征峰。而在RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan的红外光谱中均未发现RES的酚苯环吸收峰，提示RES被包合于HP-β-CD中。

2.2.5 扫描电子显微镜 精密称取少量RES原料药、RES-HP-β-CD和RES-HP-β-CD-Chitosan，涂布在带有双面黏附胶的玻璃片上，操作电压为20 kV，使用扫描电子显微镜观察不同样品粒子表面的微观形态。扫描电子显微镜图见图4。

由图4显示，RES原料药为棒状晶体，制成RES-HP-β-CD、RES-HP-β-CD-Chitosan后，药物分散均匀，且未出现RES原料药晶体，这进一步证实了RES被包合于HP-β-CD中。此外，RES-HP-β-CD-Chitosan呈球形，由于热胀冷缩现象，其表面出现收缩褶皱。

2.3 RES含量的测定

2.3.1 检测波长的选择 称取RES对照品适量，加1%醋酸溶液10 mL，超声（功率：180 W，频率：59 kHz，下同）使其溶解，加入无水乙醇定容至100 mL，在200～400 nm进行紫外扫描。按RES-HP-β-CD-Chitosan制备方法制备不含RES的空白辅料，同法制备成空白辅料溶液，在200～400 nm进行紫外扫描。结果显示，RES在307 nm波长处有最大吸收，空白辅料溶液在307 nm波长处无吸收，故确定RES的检测波长为307 nm。紫外吸收光譜图见图5。

2.3.2 线性关系的考察 精密称取RES对照品30 mg，加1%醋酸溶液10 mL，超声使其溶解，再用无水乙醇定容至100 mL。分别用移液管移取上述溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇定容，于307 nm波长处测定RES的吸光度。以吸光度为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x）进行回归分析，得回归方程为y=0.130 1x-0.009 2（R2=0.999 7），结果表明，RES检测质量浓度在1.8～6.0 µg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3 稳定性试验 精密称取RES-HP-β-CD-Chitosan适量（约相当于30 mg RES），置于100 mL量瓶中，加1%醋酸溶液10 mL，超声使其溶解，再用无水乙醇定容至刻度，再用移液管量取1 mL，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇定容制成供试品溶液。供试品溶液在室温下放置0、1、2、4、8、12 h后，于307 nm波长处测定RES的吸光度。结果，RES吸光度的RSD<1%（n=6），表明RES在室温下放置12 h的稳定性良好。

2.3.4 精密度试验 取RES对照品，按“2.2.2”项下方法制备RES质量浓度分别为2.4、4.2、5.4 μg/mL的无水乙醇溶液，于307 nm波长处测定RES的吸光度，同日内每个浓度测定3次，连续测定3 d，考察日内精密度和日间精密度。结果，RES吸光度的日内、日间RSD均<2.0%（n=3）。

2.3.5 回收率试验 称取24、30、36 mg的RES对照品，分别加入相应处方量的空白辅料，置于100 mL量瓶中，加1%醋酸溶液10 mL，超声使其溶解，并用无水乙醇定容至刻度，制备成RES质量浓度分别为2.4、3.0、3.6    μg/mL的溶液，于307 nm波长处测定RES的吸光度，计算含量。以测定值/加入值×100%计算回收率。结果，平均回收率分别为100.0%、100.24%、99.7%，RSD=1.77%（n=3）。

2.4 载药量与包封率的测定

精密称取RES-HP-β-CD-Chitosan适量（约相当于30 mg RES），置于100 mL量瓶中，加适量1 %醋酸溶液10 mL，超声使其溶解，再用无水乙醇定容至刻度，用移液管量取1 mL，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇定容。于307 nm波长处测定RES的吸光度，计算含量，再按以下公式计算载药量和包封率。载药量=微球中含药量/微球总质量×100%;包封率=微球实际含药量/微球理论含药量×100%。结果，RES-HP-β-CD-Chitosan中RES的载药量为11.67%（n=3），包封率为96.27%（n=3）。

3 讨论

为了改善RES的水溶性差的问题，本试验采用HP-β-CD包合RES，以提高RES的体外溶解度;再通过加入壳聚糖制备成RES-HP-β-CD-Chitosan，使该RES制剂在体内呈现出生物黏附特性和缓释的特性。本试验结果表明，RES在RES-HP-β-CD-Chitosan中处于分子状态或无定型状态。RES分子间的水难溶性主要是由于其分子间发生分子内的氢键键合，使其水溶性降低[15]。本研究通过采用HP-β-CD包合，避免了RES分子间氢键键合，相邻的RES分子由于HP-β-CD包合作用不能通过分子间氢键键合，以及环糊精的包合作用可以有效的增加药物的水溶性。从X射线衍射、差式扫描量热、红外光谱及扫描电镜结果来看，RES药物在制剂中以非晶形存在，由于药物以非晶形的状态存在，因此降低了药物在介质中溶解过程的活化能，使药物可以更快速地溶解，提高溶解度。再则本试验的制备方法简单可行，较容易实现工业化生产。

本文并没有测试RES-HP-β-CD-Chitosan的Zeta电位。主要是由于RES-HP-β-CD-Chitosan是固体粉末，如加入到水中混悬测定Zeta电位，会导致HP-β-CD从微球中溶解出来，不能保持其原有结构，使测定值不准确;如果使用乙醇作为分散介质来测定RES-HP-β-CD-Chitosan的Zeta电位，则会导致药物和环糊精都溶解在介质中，同样不能准确测定出Zeta电位。再则注射用的纳米制剂测定Zeta电位主要是考察制剂的稳定性。但是相比于注射的纳米制剂，本文制备的RES-HP-β-CD-Chitosan的粒径较大，制剂的粉末流动性较好;并且口服微球进入胃肠道以后，由于胃液及肠液的pH值影响，微球的Zeta电位对该制剂在体内的运输、传递及释放等方面可能影响较小。因此基于上述几点原因本研究并没有测定微球的Zeta电位。

壳聚糖是自然界广泛存在的多糖，其具有良好的生物相容性、生物黏附性，且对细胞无毒[16]。本试验制备的RES-HP-β-CD-Chitosan有可能提高RES药物的吸收主要原因如下：（1）口服后壳聚糖质子化后，可在微球表面形成凝胶，使药物缓慢释放;（2）由于细胞膜表面为负电荷，通过正、负电荷吸引壳聚糖与黏膜产生黏附作用，延长药物在胃肠道的滞留时间，从而加药物吸收[17];（3）壳聚糖可以打开肠道细胞之间连接，增加药物的吸收[18]。

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（收稿日期：2019-06-18 修回日期：2019-08-07）

（编辑：邹丽娟）