UPLC-Q-TOF/MS技术结合UNIFI数据库快速分析止痛化癥胶囊的化学成分

吴福林 王翠竹 董庆海 王涵 谭静 林红强 刘金平 李平亚

中图分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）17-2336-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.07

摘 要 目的：对止痛化癥胶囊（简称“ZTHZC”）中的化学成分进行快速鉴定，为进一步阐明其药效物质基础和全面质量控制提供参考。方法：采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF/MS）技术对ZTHZC中化学成分进行分离。通过查阅ZTHZC化学成分及其单味中草药的化学成分相关的文献报道，将化学成分的化学结构保存成.mol格式的文件，补充完善UNIFI数据库。通过UNIFI数据库筛查，对ZTHZC中化学成分进行定性分析，依据其精确分子质量、特征离子、中性丢失、二级质谱裂解规律、色谱保留行为以及结合对照品信息和文献报道等对其进行验证。结果：共鉴定出了70个化学成分，包括 38个有机酸及有机酸酯类、8个生物碱类、9个黄酮类、5个三萜皂苷类、5个醛类、2个酮类、1个醌类、1个聚炔类和1个单萜类化合物。结论：建立的方法能快速检测、鉴定ZTHZC的化学成分，本研究结果为其质量控制、药效物质基础的阐明提供了科学依据。

关键词 止痛化癥胶囊;化学成分;UNIFI数据库;超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术

Rapid Analysis of Chemical Components of Zhitong Huazheng Capsules Based on UPLC-Q-TOF/MS Technology Combined with UNIFI Database

WU Fulin，WANG Cuizhu，DONG Qinghai，WANG Han，TAN Jing，LIN Hongqiang，LIU Jinping，LI Pingya（School of Pharmacy， Jilin University， Changchun 130021， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To rapidly identify chemical components of Zhitong huazheng capsules （shorted for “ZTHZC”）， and to provide reference for further elucidating the pharmacodynamic material basis and overall quality control. METHODS： UPLC-Q-TOF/MS method was adopted to separate the chemical components of ZTHZC. By reviewing literatures that related to chemical components of ZTHZC and its single Chinese traditional medicinal crops， the chemical structure of the chemical components was saved into a .mol format file， and supplemented the UNIFI database. The chemical constituents of ZTHZC were qualitatively analyzed by UNIFI database screening， and validated according to their precise molecular mass， characteristic ions， neutral loss， secondary mass spectrometry cleavage， chromatographic retention behavior， combined reference information and literature reports. RESULTS： A total of 70 chemical components were identified in this experiment， including 38 organic acids and organic acid esters， 8 alkaloids， 9 flavonoids， 5 triterpenoid saponins， 5 aldehydes， 2 ketones， 1 quinone， 1 polyacetylene and 1 monoterpenoid. CONCLUSIONS： This study provides a rapid detection and identification method for chemical components of ZTHZC， and also provides a scientific basis for the clarification of ZTHZC’s quality control and pharmacodynamics.

KEYWORDS Zhitong huazheng capsules; Chemical components; UNIFI database; UPLC-Q-TOF/MS

止痛化癥膠囊（简称“ZTHZC”）是由党参、炙黄芪、炒白术、丹参、当归、鸡血藤、三棱等19味中药炮制而成，主治益气活血、散结止痛，用于气虚血瘀所致的月经不调、痛经，症见行经后错、经量少、有血块、行经小腹疼痛，慢性盆腔炎见上述证候者[1]。临床上将其广泛用于治疗痛经、盆腔炎及子宫腺肌病等妇科疾病[2-5]，疗效甚好。目前，对于ZTHZC化学成分的研究主要集中在几种有效成分（如丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B）的含量测定上[6-8]，制剂中许多其他化学成分还未明确。而中药复方具有多成分、多靶点的特点，因此，对于ZTHZC药效物质基础需要进一步研究。

近年来，超高效液相色谱与飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF/MS）技术已经成为天然药物中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。而UNIFI数据库是一个简单、高效、全面的平台，包括从600多种中药中发现的6 000多种化合物信息，能够将数据采集、峰提取、分子式确定、数据库检索及生成报告相结合，对化学成分进行快速、全面地定性分析[9]。将UPLC-Q- TOF/MS与UNIFI数据库相结合，已经被应用到传统中药及复方中化学成分的快速鉴定中[10-12]。基于此，本研究将采用UPLC-Q-TOF/MS技术结合UNIFI数据库，对ZTHZC的化学成分进行快速、全面的筛查分析，为进一步阐明其药效物质基础以及全面的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Xevo G2-XS Q-TOF四级杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC 二元泵和样品管理器（美国Waters公司）;N-A35氮气发生器（上海金浪科技有限公司）;FA1104N 电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）;R501旋转蒸发仪（上海豫康科教仪器设备有限公司）;TGL-16aR飞鸽超离速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

ZTHZC（吉林金宝药业股份有限公司，批号：20161010，规格：0.3 g/粒）;木樨草素（批号：111520- 200504）、阿魏酸（批号：110773-201012）、山柰酚（批号：110861-201310）、柠檬酸（批号：111679-201602）、咖啡酸（批号：110885-201102）、咖啡酸乙酯（批号：111678- 200401）、原儿茶醛（批号：110810-200205）、黄芪甲苷（批号：0781-200311）、迷迭香酸（批号：11871-2001102）、双氢槲皮素（批号：180317）等10个对照品均购自中国食品药品检定研究院（纯度：均≥98%）;延胡索乙素（批号：17022720）、党参炔苷（批号：17062207）、紫草酸（批号：171220）、奎宁酸（批号：20150321）、丹酚酸B（批号：150927）、芒柄花黄素（批号：17031005）、丹参素（批号：151106）、原儿茶酸（批号：171109）、丹酚酸A（批号：171217）、丹酚酸C（批号：171105）等10个对照品均购自北京普天同创生物科技有限公司（纯度：均≥98%）;乙腈（美国Fisher公司，色谱级）;甲酸钠、亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司，色谱级）;水为屈臣氏纯净水。

2 方法

2.1 样品溶液的制备

取ZTHZC内容物，研细，过40目筛。取粉末约1 g，用80%甲醇在80 ℃水浴中提取3次，每次3 h，合并3次提取液。将提取液过滤后，将滤液合并，旋干。用80%甲醇1.0 mL将提取物溶解，过0.22 µm滤膜，收集滤液，备用。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称定对照品木樨草素0.001 1 g、阿魏酸0.001 0 g、山柰酚0.001 2 g、柠檬酸0.001 3 g、咖啡酸0.001 5 g、咖啡酸乙酯0.001 6 g、原儿茶醛0.001 8 g、黄芪甲苷0.002 1 g、迷迭香酸0.001 5 g、双氢槲皮素0.001 9 g、延胡索乙素0.002 5 g、党参炔苷0.001 1 g、紫草酸0.002 6 g、奎宁酸0.001 4 g、丹酚酸B 0.002 7 g、芒柄花黄素0.002 3 g、丹参素0.002 4 g、原儿茶酸0.002 1 g、丹酚酸A 0.001 6 g、丹酚酸C 0.002 6 g，置于同一10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容，即得。

2.3 检测条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫：30 ℃;样品管理器温度：15 ℃;流动相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，10%B;2～26 min，10%→90%B;26～28 min，90%B;28～29 min，90%→10%B;29～30 min，10%B）;流速：0.4 mL/min;进样体积：10 μL。

2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源（ESI），连续扫描模式，采用正、负离子检测模式（ESI+、ESI-）;扫描范围：质荷比（m/z）100～1 500;毛细管电压：3.0 kV;锥孔电压：40 V;锥孔气流量：50 L/h;脱溶剂氮气流量：600 L/h;氩气流量：0.15 mL/min;离子化源温度：120 ℃;脱溶剂气温度：300 ℃。采用亮氨酸-脑啡肽[M+H]+质荷比（m/z）为556.277 1、[M-H]- m/z为 554.262 0作为Lock Spray校正标准液（100 pg/mL），对仪器进行实时校正，其校正流速为正离子模式（15 μL/min），使用甲酸钠溶液对仪器进行校正。

2.4 数据的采集与处理

取“2.1”项下样品溶液，按“2.3”项下条件进行分析，记录图谱。采用UPLC-Q-TOF/MS 模式采集数据，使用UNIFI数据库软件进行ZTHZC化学成分的自动识别。第一步，先通过查阅ZTHZC化学成分及其单味中草药的化学成分相关的文献报道，将化学成分的化学结构保存成.mol格式的文件，然后导入UNIFI数据库中，作为原有的传统中药库的补充，并建立了ZTHZC数据库;第二步，将原始数据通过Waters Compression and Archival Tool v1.10软件进行压缩;第三步，应用UNIFI数据库软件自动筛查、鉴定化合物，代替传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片断裂情况;第四步，建立一个过滤筛选方法，即设定质量误差为-5～5 ppm，且响应值大于3 000;最后，通过结合碎片离子理论精确质量数、相对保留时间和分子式匹配软件Elemental composition、化合物结构匹配软件MassFragment、离线及在线质谱数据库（PubMed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）及相关文献对各主要化合物进行人工识别和确认。

3 结果

在ZTHZC中共检测到70个化合物，包括38个有机酸及有机酸酯、8个生物碱、9个黄酮、5个三萜皂苷、5个醛类、2个酮类、1个醌类、1个聚炔类和1个单萜类化合物。ESI+、ESI-模式下的质谱基峰离子流图见图1，化合物的鉴定结果见表1，ZTHZC中鉴定出的各类化合物的结构图见图2。

3.1 有机酸及有机酸酯类化合物的鉴定

有机酸及有机酸酯类化合物是ZTHZC的主要活性成分，基于UNIFI数据库所推断出的裂解碎片，结合相关参考文献的质谱数据及对照品比对的方法，鉴定出有机酸及有机酸酯类化合物38个，下面以化合物6和化合物65为例，简述其鉴定过程。

（1）化合物6：在ESI-模式下，化合物6的保留时间为1.03 min，准分子离子峰m/z 196.972 7[M-H]-;以m/z 196.972 7[M-H]-为母离子进行二级质谱（MS/MS）扫描，主要产生3个碎片离子，即m/z 178.966 7[M-H- H2O]-、m/z 152.961 0[M-H-HCOOH] -、m/z 134.993 3[M-H-H2O- HCOOH]-，与丹参素对照品的碎片离子基本一致，再结合文献[13]报道，可将其鉴定为丹参素。丹参素对照品和化合物6的MS/MS图见图3。

（2）化合物65：在ESI-模式下，化合物65的保留时间为25.02 min，准分子离子峰m/z 281.248 7[M-H]-;以m/z 281.248 7[M-H]-为母离子进行MS/MS扫描，主要产生1个碎片离子，即m/z 265.051 7[M-H-CH3]-，再结合文献[14]报道，可将其鉴定为棕榈油酸乙酯。化合物65的MS/MS图见图4。

3.2 生物碱类化合物的鉴定

在ESI+模式下，生物碱类化合物共鉴定出8个，下面以化合物23为例，简述其鉴定过程：化合物23保留时间为6.64 min，准分子离子峰m/z 356.185 6[M+H]+，以m/z 356.185 6[M+H]+为母离子进行MS/MS扫描，主要产生5个碎片离子，即分别为m/z 341.158 2[M+H-CH3]+，m/z 310.136 1[M+H-CH3-OCH3]+，m/z 192.100 9[M+H-C10H12O2]+，m/z 178.085 9[M+H-C11H14O2]+， m/z 150.064 5[M+H- C12H15O2N]+，与延胡索乙素对照品的碎片离子基本一致，再结合文献[15]报道，可将其鉴定为延胡索乙素。延胡索乙素对照品和化合物23的MS/MS图见图5。

3.3 黄酮类化合物的鉴定

在ESI-模式下，黄酮类化合物共鉴定出9个，下面以化合物43为例，简述其鉴定过程：化合物43保留时间为10.51 min，准分子离子峰m/z 267.942 6[M-H]-;以m/z 267.942 6[M-H]-为母离子进行MS/MS扫描，主要产生1个碎片离子，即m/z 251.004 4[M-H-CH3]-，这与芒柄花黄素对照品的碎片离子基本一致，再结合文献[16]报道，可将其鉴定为芒柄花黄素。芒柄花黄素对照品和化合物43的MS/MS图见图6。

3.4 三萜皂苷类化合物的鉴定

在ESI-模式下，三萜皂苷类化合物共鉴定出5个，下面以化合物47为例，简述其鉴定过程：化合物47保留时间为11.91 min，准分子离子m/z 871.454 5[M+HCOO]-;以m/z 871.454 5 [M+HCOO]-为母离子进行MS/MS扫描，主要产生2个碎片离子，即m/z 697.418 2[M-COCH3-C4H8O2]-，m/z 667.167 8[M-H-OCOCH3- C5H10O2]-。結合文献[17]报道，可将其鉴定为黄芪皂苷Ⅱ。化合物47的MS/MS图见图7。

3.5 醛类、酮类及其他类化合物的鉴定

应用提取离子色谱法结合UNIFI数据分析平台，在ESI+、ESI-检测模式下，推断出5个醛类，2个酮类及其他类成分（包括1个醌类、1个聚炔类、1个单萜类化合物），其鉴定过程同上（不再一一列出）。

4 讨论

在本研究中，笔者首次运用 UPLC-Q-TOF/MS技术结合UNIFI数据分析平台定性分析了ZTHZC中的化学成分。UPLC能够对各成分进行高效地分离，Q-TOF- MS具有高灵敏度、高分辨率，能够进行精准检测，Q-TOF/MS的MS数据采集模式可通过低碰撞能扫描和高碰撞能扫描之间快速切换同时完成两种扫描功能的数据采集，排除假阳性结果，同时进行母离子、子离子、中性缺失分析。在低碰撞能扫描下得到相关分子离子峰及其加合峰的信息，在高碰撞能扫描下得到相关碎片峰的信息，两者再通过保留时间进行关联，UNIFI能够进行快速筛查鉴定，将三者结合，即可实现快速地分离、检测、鉴定ZTHZC的化学成分。本研究共鉴定了70个化学成分，包括38个有机酸及有机酸酯类、8个生物碱类、9个黄酮类、5个三萜皂苷类、5个醛类、2个酮类、1个醌类、1个聚炔类和1个单萜类化合物。2015年版《中国药典》（一部）规定，利用薄层色谱法进行丹参鉴别和采用高效液相色谱法测定丹参素的含量来控制止痛化癥胶囊的质量[1]，但是对于中药大复方，单一的成分含量测定不足以反映药品的整体质量。而本研究检测到的丹酚酸B等酚酸类、延胡索乙素等生物碱类及黄芪甲苷等都可作为质量控制标准，可保障药品更加有效、安全。本研究为中药材及中药复方化学成分的分析提供了一种快速检测的方法，同时也为ZTHZC的质量控制、药效物质基础的阐明提供了科学依据。

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（收稿日期：2019-04-02 修回日期：2019-05-20）

（编辑：林 静）