二甲双胍对变应性鼻炎小鼠炎性状态的影响

张国正，连 荣，苗文杰，余文发

(新乡医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，河南 卫辉 453100)

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是指机体在接触特定变应原以后由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，临床表现多以鼻塞、流涕、喷嚏和鼻痒为主[1]。AR发病机制多认为是由辅助性T细胞1(T-helper 1，Th1)/辅助性T细胞2(T-helper 2，Th2)免疫失衡紊乱导致，即Th2细胞过度极化及其相应的炎性因子过度分泌诱导的炎症反应[2]。但有研究认为，Th17细胞在AR的发病机制中具有重要作用，白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)作为Th17细胞分泌的主要细胞因子之一，对中性粒细胞和巨噬细胞在局部炎症部位的募集具有强大的促进作用，从而导致局部慢性炎性状态[3-4]。IL-17参与多种呼吸道变态反应性疾病，吕文漪等[5]研究认为，IL-17在哮喘患者血清和痰液中的表达水平显著升高，主要与呼吸道高反应性的炎症程度密切相关；刘春苗等[6]研究发现，变应原为尘螨的AR患者血清IL-17表达水平明显升高，且与病情的严重程度呈正相关。IL-17主要通过活化蛋白酪氨酸激酶/信号转导及转录激活因子(janus protein tyrosine kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信号转导通路发挥作用，而STAT3是JAK/STAT信号转导途径中最为关键的核转录因子之一，活性形式为磷酸化STAT3(phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)，其在AR患者鼻黏膜局部免疫调节中具有重要的生物学作用[7]。二甲双胍是一种临床广泛应用于治疗2型糖尿病的降糖药，但最近研究认为，二甲双胍可特异性抑制JAK/STAT3信号转导通路，从而降低IL-17表达[8-9]。结合上述文献报道，考虑二甲双胍对于AR具有潜在的治疗作用，因此，本研究通过构建卵清蛋白诱导的AR小鼠模型，观察二甲双胍对AR模型小鼠炎性状态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄雄性无特定病原体级BALB/c小鼠30只，购自河南新乡华兰生物实验动物中心[实验动物合格证号：201801130025，动物生产许可证号：SCXK(豫)2015-0001]，体质量18～20 g，在室温(24±1) ℃及明、暗各12 h的条件下自由取食(高压蒸汽灭菌用水及正常饲料喂养)。

1.2 主要试剂与仪器二甲双胍粉剂购自美国Sigma公司，抗IL-17兔抗、抗p-STAT3兔抗购自英国Abcam公司，鼠血清IL-17和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)检测试剂盒购自美国R&D公司，鼠血清IL-6检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；酶标仪购自美国Thermo Fsiher Scientific公司，Amersham Imager600凝胶系统成像仪购自日本GE Healthcare公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与处理将30只小鼠随机分为对照组、模型组和二甲双胍组，每组10只。将100 μg卵清蛋白联合2 mg AL(OH)3溶于0.1 mL 生理盐水中，造模的第1、3、5、7、9、11、13、15天对模型组和二甲双胍组小鼠进行腹腔注射，每日1次，每次0.1 mL;第16天开始将500 μg卵清蛋白溶于10 μL生理盐水中，对模型组和二甲双胍组小鼠进行滴鼻，每鼻孔10 μL，每日1次，连续激发11 d。二甲双胍组小鼠在造模同时每天给予150 g·L-1二甲双胍溶液0.3 mL腹腔注射，连续25 d。对照组小鼠每日给予生理盐水腹腔注射,每日1次，每次0.4 mL，连续 25 d；生理盐水滴鼻，每日1次，每次10 μL，连续11 d。

1.3.2 各组小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平测定造模成功后，各组小鼠经眼球取血2～5 mL，常温下离心收集上层血清并置于-80 ℃冰箱中保存。采用酶联免疫吸附试验检测血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，酶联免疫吸附试验具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 Western blot法检测各组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3的表达造模成功后，眼球取血备用，采用断颈法处死小鼠，并取鼻黏膜组织，置于高温灭菌且经液氮预冷后的研钵中，加入液氮研磨成粉末后移入1.5 mL的EP管，加入500 μL含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)和蛋白酶抑制剂的放射免疫测定(radioimmuno-precipi-tation assay，RIPA)裂解液，冰上孵育约30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，吸取上清液至新的EP管进行分装，-80 ℃冰箱中保存。配置上层和下层胶并插入梳子,待胶凝固后加入5 μL蛋白样品和Marker，加样进行电泳，电泳结束后取出凝胶，剪相应大小的聚偏二氟乙烯膜，加入电转液中进行电转，牛奶封闭，加入一抗 IL-17(11 000)抗体、p-STAT3(11 000)抗体、β-actin (11 000) 4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(11 000)孵育1 h，采用化学发光法检测目的条带的灰度值，蛋白表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。所有实验重复3次。

2 结果

2.1 3组小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α表达水平比较结果见表1。二甲双胍组和模型组小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；二甲双胍组小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组小鼠血清炎性因子水平比较

组别nIL-17/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)对照组1017.18±3.072.67±0.62133.98±5.34模型组1056.34±6.29a12.87±1.46a287.18±10.11a二甲双胍组1036.72±2.55ab8.28±0.92ab248.54±20.65ab

注：与对照组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。

2.2 3组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3蛋白表达水平比较结果见图1和表2。二甲双胍组和模型组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3蛋白表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);二甲双胍组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3蛋白表达水平显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

1：模型组；2：二甲双胍组；3：对照组。

图1 3组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3蛋白的表达 (Western blot)

Fig.1 Expression of IL-17 and p-STAT3 protein in nasal mucosa of mice in the three groups (Western blot)

表2 3组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和p-STAT3蛋白表达比较

组别nIL-17p-STAT3对照组100.13±0.020.05±0.01模型组101.10±0.14a1.36±0.23a二甲双胍组100.43±0.02ab0.28±0.01ab

注：与对照组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。

3 讨论

二甲双胍作为一种常用的双胍类降糖药已在临床上使用多年，但最近多项研究认为，二甲双胍除了降糖作用外，还具有抗炎、调节肠道菌群、保护神经功能、抑制角质形成细胞及肿瘤细胞过度增殖等作用[8-12]。研究发现，IL-17能通过JAK/STAT信号传导途径调节肿瘤细胞的局部浸润转移，IL-17也可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidy-linositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路，促进炎性因子IL-6和TNF-α的释放，而二甲双胍可通过抑制JAK/STAT3信号转导通路而抑制肿瘤细胞再生[8-9]。IL-17作为一种重要的炎性因子参与众多变态反应性疾病，宋辉等[13]研究发现，AR小鼠黏膜组织中IL-17 mRNA表达水平显著升高，故而参考既往文献报道结果[6,13]，作者认为 IL-17的高表达在AR的发病机制中可能具有显著作用，同时，关于二甲双胍和AR相关性研究报道较少，因此，本研究采用卵清蛋白构建AR小鼠模型，探讨二甲双胍干预对AR小鼠炎性状态的影响。

前期预实验结果表明，仅150 g·L-1二甲双胍溶液0.3 mL腹腔注射时，3组小鼠血糖水平比较差异无统计学意义。因此，本研究最终选择 150 g·L-1二甲双胍进行干预处理。本研究结果显示，二甲双胍组小鼠鼻黏膜组织中IL-17和 p-STAT3 蛋白表达水平显著低于模型组，但高于对照组；提示二甲双胍对AR可能具有一定的治疗作用，其机制可能与抑制p-STAT3和IL-17的蛋白表达有关。本研究结果还发现，二甲双胍可明显抑制血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，提示二甲双胍也可减轻AR小鼠的炎症状态。葛安琪等[14]采用二甲双胍对骨癌痛模型小鼠干预处理后发现，小鼠脊髓背角中p-STAT3蛋白表达显著降低；杨明峰等[15]采用二甲双胍对胶原诱导性关节炎模型大鼠干预处理后也发现大鼠脾脏Th17细胞和IL-17表达显著降低；以上研究结果与本实验结果基本一致，间接证实二甲双胍能抑制p-STAT3和IL-17的表达。

综上所述，二甲双胍在一定程度上可减轻AR模型小鼠鼻黏膜组织的炎症状态，并降低外周血炎性因子的表达水平，其机制可能与抑制p-STAT3蛋白表达有关，本研究为今后实现STAT3单克隆抗体治疗AR提供理论依据。本研究未探讨在沉默STAT3基因的情况下采用二甲双胍干预后各炎性因子的变化，下一步应当获取AR患者鼻黏膜组织及外周血，进一步验证本研究中的相关指标与动物实验结果是否一致。