鲱辣椒中益生细菌的计数与分离鉴定及功能研究

王琦　张紫娟　罗艳萍　黄承婷　何溢昕　胡俊升　凌洁玉

摘要为获得优良的益生菌株，在鲱辣椒发酵过程中对其芽孢杆菌及乳酸菌进行计数。结果表明，其均在第4天达到最高值。从该时期共分离得到9株芽孢杆菌与10株乳酸菌，其中蜡样芽孢杆菌与植物乳杆菌占优势。5株芽孢杆菌对龙虾残饵降解研究表明，B1与B18这2株蜡样芽孢杆菌在48h对残饵中淀粉降解率都高达60%以上，对蛋白的降解率达到50%以上，是净水的优良候选菌株。4株乳酸菌体外抗氧化研究表明，L1乳酸乳球菌乳酸亚种产酸最强，而抗氧化活性也最高，且含有丰富的胞外多糖，可作为发酵乳制品的候选菌株。

关键词 鲱辣椒;芽孢杆菌;乳酸菌;分离鉴定;残饵降解;抗氧化

中图分类号 S641.3;TS255.3

文献标识码 A

文章编号 1007-5739（2019）07-0199-02

鲱辣椒是流行于湖北、湖南、四川等省山区的一种传统佐餐食品，它以玉米粉配以新鲜红辣椒，经过15～30d的自然发酵而制成。随着旅游业的发展，鲱辣椒开始进人大众视野并以其独特风味受到消费者的欢迎。到目前为止，关于鲱辣椒的研究报道并不多，已经有少量研究表明，其在发酵过程中的微生物菌群包括乳酸菌、芽孢杆菌醋酸杆菌和酵母菌等"，但是极少进一步对这些菌进行分离鉴定和益生作用分析。同众多发酵食品，鲱辣椒是益生菌的天然来源e，因而本研究对鲱辣椒发酵过程中的芽孢杆菌和乳酸菌进行计数和分离鉴定，并且选取代表性菌株对其益生功能进行了初步探索，以期获得优良的益生菌株，用于食品以及環保等领域。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜玉米粉红辣椒姜蒜、食盐等鲱辣椒制备原料，均购于正规超市;龙虾配合饲料购于湖北濮阳饲料有限公司。

MRS培养基、芽孢杆菌计数培养基购于青岛海博生物技术有限公司;rTaq聚合酶dNTP购于TaKaRa公司;DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司;DPPH、焦性没食子酸、水杨酸、30%过氧化氢、碘、硝酸钙、考马斯亮蓝G-250等化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

引物序列由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成，其中乳酸菌的扩增引物为27F（5一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）与1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）;芽孢杆菌的扩增引物为16sF（5'-TGACGAGTGGCGGACGGGTG-3'）与16sR（5'-CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG-3'）。

1.2试验方法

1.2.1鲱辣椒的制备。按照农家常规做法，将新鲜红辣椒洗净切碎，与玉米粉以1：5混匀，加入适量的盐姜、蒜，装坛液封，于25C恒温发酵16d。

1.2.2益生菌计数及分离鉴定在鲱辣椒发酵过程中，每隔4d取样分别进行芽孢杆菌和乳酸菌计数。芽孢杆菌采用专用的芽孢杆菌计数培养基，379C培养48h;乳酸菌采用MRS琼脂培养基，37C厌氧培养72h。

对发酵第4天的计数平板，挑取典型菌落，纯化2代直至镜检形态一致，挑取单菌落进行液体培养，并提取其DNA，采用PCR扩增其16SrDNA。芽孢杆菌PCR条件为：949C预变性5min;94C变性30s，65C退火30s，72°C延伸1min，30个循环;72°C延伸7min。乳酸菌PCR条件为：94C预变性5min;94C变性1min，53C退火1min，72C延伸1.5min，30个循环;72C延伸10min。PCR产物送于武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果于NCBI数据库进行序列比对。

1.2.3芽孢杆菌对残余饵料降解的研究。将同时具有淀粉酶活与蛋白酶活的芽孢杆菌，采用牛肉膏蛋白胨培养基活化2代，以5%接种量接种到模拟龙虾残余饵料培养基8（1g龙虾饲料加人100mL蒸馏水，121C灭菌25min，静置，过夜后使用），28C振荡培养，于48、72h取样，分别测定其淀粉及蛋白质的含量，以未接菌的饵料培养基作为对照。淀粉含量测定采用碘显色法+，蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[4。

1.2.4乳酸菌的体外抗氧化研究。选择产酸较强的乳酸菌株接种于MRS液体培养基，活化2代，取其发酵上清液进行抗氧化性研究和胞外多糖提取。羟自由基（·0H）、DPPH自由基（DPPH·）与超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力测定，以吸胞外多糖的提取和测定均参照杨晨璐等的方法。

2结果与分析

2.1鲱辣椒发酵过程中芽孢杆菌、乳酸菌数量变化及分离鉴定

在鲱辣椒发酵过程中，每隔4d对其芽孢杆菌及乳酸菌进行计数。由图1可知，芽孢杆菌数量在整个发酵期间变化较小，维持在1x104CFU/g左右，在第4天略高。而乳酸菌数量急剧上升，从初始8x103CFU/g上升到第4天的最高值1.5x10*CFU/g。芽孢杆菌能产生淀粉酶、蛋白酶等多种胞外酶类，将原料中的淀粉、蛋白质等分解成更易吸收的小分子糖类、多肽、氨基酸等物质，赋予了鲱辣椒更高的营养价值;而乳酸菌发酵产生乳酸，使鲱辣椒具有柔和的酸味，且和其他菌共同作用产生醛酮、醇等物质，赋予鲱辣椒独特的风味"。

已有研究选用发酵完成的成品对鲱辣椒中乳酸菌进行分离鉴定凹，为了更广泛地挖掘益生菌株，在计数结果最高的4d进行芽孢杆菌和乳酸菌的分离鉴定。经形态学鉴定和16SrDNA鉴定，共得到9株芽孢杆菌，其中蜡样芽孢杆菌最多，其次是解淀粉芽孢杆菌;共得到10株乳酸菌，其中3株乳球菌，7株乳杆菌。由表1可知，在鲱辣椒发酵前期，蜡样芽胞杆菌与植物乳杆菌为优势菌群。

2.2芽孢杆菌对龙虾残饵降解的影响

产酶平板初筛结果表明，芽孢杆菌B1、B4、B18、B29、B30均同时具有较好的淀粉酶和蛋白酶活性。目前，对益生芽孢杆菌产酶的应用，集中在将其作为饲料添加剂，以提高动物对饲料的利用率4。但实际上，这些酶同样可以作用于残余饲料，如在水产养殖中，用于降解残余饵料，从而降低养殖水体的有机物污染，目前相关研究较少B。

小龙虾是湖北省重点养殖的淡水鳌虾，其养殖水温与鲱辣椒的发酵温度相差较小，故人工模拟龙虾养殖水体中残饵浓度，研究这些芽孢杆菌对龙虾饲料中淀粉及蛋白质的降解情况。由图2、3可知，5株芽孢杆菌对残饵中的淀粉均有较强的降解能力，除B30降解速度较缓慢外，其他4株菌在48h的降解率均达到60%以。上。对残饵中蛋白质的降解，B4与B29较弱，而其他3株菌都达到50%以，上。综合来看，B1与B18这2株蜡样芽孢杆菌对淀粉及蛋白质的降解率均较高，且作用迅速、稳定，是较优良的候选菌株。

2.3乳酸菌体外抗氧化性

钙溶圈大小表明，L1、L8、L30、L31这4株乳酸菌产酸较高，对这4株菌进行了体外抗氧化能力的初步研究和胞外多糖含量测定，结果如表2所示。

4株乳酸菌的发酵液对3种自由基都具有一定的清除能力，其中对·OH清除能力最突出，均达99%以上，高于1mg/mLVc的清除率。L1乳酸乳球菌乳酸亚种对DPPH.及02.也表现出更高的清除活性，抗氧化性良好，因其在4株菌中产酸也最高，故可作为发酵乳制品等产品的优良候选菌株。从表2还可以看出，4株乳酸菌胞外多糖含量均大于200μg/mL。众多研究表明，胞外多糖能增加发酵乳制品的黏度和稳定性0，并能够发挥抗氧化和抑菌等功能。

3结论与讨论

发酵食品是益生菌的天然来源，鲱辣椒作为较独特的发酵谷物制品，其所含益生菌值得探究。本试验从发酵第4天的鲱辣椒中共分离得到9株芽孢杆菌和10株乳酸菌，是首次从鲱辣椒中进行芽孢杆菌的分离鉴定。

5株芽孢杆菌对模拟龙虾残饵均有一定的降解能力，其中B1与B18对淀粉的降解率均达到60%以上，对蛋白的降解率均达到50%以上，且作用稳定、迅速，是较优良的净水候选菌株。传统鲱辣椒发酵温度通常在25～30C之间，且其原料玉米与水产饲料都是富含淀粉和蛋白质等有机物，因而其中的芽孢杆菌可能适合用于养殖水体的净化。这只是前期的一个模拟研究，其芽孢杆菌是否适于在真正的龙虾养殖水体中生长8，是否对水体污染的直接指标如化学需氧量、氨氮和亚硝氮等有改善作用，有待于后期进一步研究。

采用4株产酸较强的乳酸菌进行体外抗氧化研究表明，产酸最强的LI乳酸乳球菌乳酸亚种对DPPH·、·0H和O2-·均具有较高的清除率，尤其对.OH清除能力高于1mg/mL的Ve，且含较高量的胞外多糖，可作为发酵乳制品等产品的优良候选菌株。

总体而言，鲱辣椒中益生菌含量丰富，不仅该产品本身因受益生菌作用而风味独特、营养丰富，还能从中发掘出许多益生菌株用于其他食品或環境保护等领域。

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