不同加工阶段对上海熏鱼（草鱼）风味物质的影响

薛永霞，张作乾，张洪才，张 菊，卫赛超，陈舜胜,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.国家淡水水产品加工技术研发中心（上海），上海 201306）

我国淡水资源丰富，2016年草鱼产量为590万 t，居于淡水养殖鱼类产量首位，占20.96%[1]。目前，草鱼主要以生鲜销售为主，其贮藏期较短，生产受到地域和季节的限制，若集中上市，易造成产品积压和腐败变质，从而导致资源浪费，制约淡水渔业的发展[2]。此外，草鱼固有的腥味令消费者难以接受，去除淡水鱼固有的腥味近年来受到高度关注。通过上海熏鱼的加工方式不仅可以保持草鱼本身的营养与风味物质，还能改善其固有的腥味，以丰富市场产品供应和满足消费者需求。目前，国内对于草鱼风味成分的研究主要集中在生鲜鱼肉及其制品，极少研究熟制鱼肉及其制品的风味成分。陈桂平[3]研究了草鱼低温贮藏期间风味成分的变化，李金林等[4]研究了传统鱼汤烹煮过程中挥发性成分的变化，但并未对不同加工阶段熟制鱼肉风味物质的变化进行研究报道。上海熏鱼是一道沪系特色传统名菜，一般以草鱼为加工原料，深受江南地区居民喜爱。上海熏鱼风味形成于不同加工阶段，但其不同加工阶段对上海熏鱼风味成分的影响尚不明确。

本实验采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氨基酸自动分析法和固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry， SPME-GC-MS）法对不同加工阶段上海熏鱼的核苷酸、游离氨基酸和挥发性物质进行鉴定与分析，确定不同加工阶段上海熏鱼风味成分及其关键风味物质，以丰富淡水鱼风味化学的理论知识和为淡水鱼的深加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草鱼，约2.5 kg/尾，购自上海市浦东新区古棕路农工商超市，经充氧运回。急杀后，去除鱼鳞、鱼鳍、内脏等，洗净后切段（1.5 cm左右）。

腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）标准品、二磷酸腺苷酸（adenosine diphosphate，ADP）标准品、肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）标准品、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）标准品 美国Sigma公司；一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）标准品、次黄嘌呤核苷（insoine，HxR）标准品 日本TCI公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇（均为色谱纯），高氯酸（perchloric acid，PCA）、氢氧化钾、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；17 种氨基酸混标为色谱纯 中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所。

1.2 仪器与设备

W2690/5 HPLC仪 美国Waters公司；L-8800氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司；涂层厚度65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）固相微萃取头 美国Supelco公司；6890-5975 GC-MS联用仪 美国Agilent公司；AUW320电子分析天平 日本岛津公司；H2050R高速冷冻离心机 长沙湘仪有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；HY-81电热炸锅 佛山市南海泊菲机电设备有限公司；ZQ02CJ2不黏锅 浙江爱仕达电器股份有限公司；JYC-21HEC05电磁炉 九阳股份有限公司；DW-25W300低温冰箱 上海圣科仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工艺

传统上海熏鱼加工分为3 个阶段：第1次浸渍（30 min）→油爆（180 ℃，5 min）→第2次浸渍（1 min）。其中，第1次浸渍：料酒（20%）、食用盐（1.5%）、葱（2%）、姜（1%）、蒜（1%）、胡椒粉（1%）和生抽酱油（5%）浸渍30 min。油爆：油爆温度180 ℃，油爆时间5 min。第2次浸渍：葵花籽油（5%）、五香粉（0.1%）、白砂糖（3%）、生抽酱油（10%）、水（60%）熬制10 min后浸渍1 min。

本实验研究上海熏鱼加工过程中的5 个阶段：生鲜草鱼（A0）、一次浸渍（A8）、生鲜油爆（B0，生鲜草鱼直接油爆）、一次浸渍后油爆（B8）、一次浸渍后油爆，再二次浸渍（C3，上海熏鱼）。浸渍和油爆后鱼肉均沥干料液与油。

1.3.2 核苷酸类化合物测定

参考Yokoyama等[5]的方法测定。分别称取5.00 g样品于50 mL离心管中，加入质量分数为10%的PCA溶液10 mL，匀浆后冷冻离心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），取上清液，用5 mL 5%的PCA溶液洗涤沉淀，再次离心，重复以上操作2 次，合并上清液，用10 mol/L和1 mol/L的KOH溶液调节pH值至6.50，静置30 min，取上清液定容到50 mL，摇匀，过0.22 μm膜后待测。整个处理过程均在0～4 ℃条件下操作。

HPLC条件：ODS-SPC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），保护柱柱芯（4 mm×10 mm，5 μm）；流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾（1∶1，V/V）溶液，用磷酸调节pH值至6.50，流动相B为甲醇溶液，等梯度洗脱；流速1 mL/min；柱温28 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。

1.3.3 游离氨基酸测定

参考陈剑岚等[6]的分析方法。分别称取2.00 g样品，加入15 mL质量分数为15%的TCA溶液，匀浆后静置2 h，冷冻离心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），取上清液5 mL，用3 mol/L的NaOH溶液调pH值至2.00，定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm膜后待测。

氨基酸自动分析仪条件：色谱柱（4.6 mm×60 mm）；分离树脂：阳离子交换树脂；柱温度：57 ℃；检测波长：570 nm（脯氨酸440 nm）；1通道缓冲溶液流速：0.40 mL/min；反应液：茚三酮试剂；2通道反应液流速：0.35 mL/min；进样量：20 μL。

1.3.4 GC-MS分析

准确称取搅碎后的鱼肉2.5 0 g，然后加入2.50 mL 0.18 g/mL NaCl溶液，匀浆后迅速置于20 mL顶空瓶中加盖待测。顶空固相微萃取条件：采用65 μm PDMS/DVB固相微萃取头，萃取温度45 ℃，萃取时间40 min。

色谱条件：程序升温[7]：柱初温40 ℃，保持2 min，之后以4 ℃/min升至160 ℃，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；不分流模式进样；载气（He）流量：1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；解吸温度250 ℃；解吸时间5 min。质谱条件：传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z35～350。

数据分析：挥发性成分通过NIST 02和Wiley质谱数据库进行匹配定性，且当正反匹配度均大于800（最大值为1 000）的化合物才予以报道[8-9]。采用面积归一化法计算各样品中挥发性成分的相对含量，以定量样品中挥发性成分，然后对数据用SPSS17.0软件进行方差和显著性分析[10]。

1.3.5 关键风味化合物的确定[11]

采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法，对样品总体风味贡献最大的组分ROAVstan为100，对其他挥发性成分按以下公式计算：

式中：Cri和Ti分别为各挥发性物质的相对含量和相应的感觉阈值；Crstan和Tstan分别为样品总体风味贡献最大组分的相对含量和相应的感觉阈值。

所有组分：0≤ROAV≤100，ROAV值越大表明该组分对样品总体风味贡献程度越大；ROAV≥1，对样品总体风味贡献显著，为该样品的关键风味化合物。

1.4 数据处理

核苷酸类化合物和游离氨基酸数据采用SPSS Statistics 17.0对数据进行方差分析，同时采用Duncan法进行显著性分析[10]。

2 结果与分析

2.1 不同加工阶段上海熏鱼的核苷酸含量分析

表1 不同加工阶段上海熏鱼的核苷酸含量Table 1 Nucleotide contents of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

由表1可知，不同加工阶段对草鱼肉核苷酸类的含量有较明显影响。AMP在生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中的含量分别为13.54、5.96、14.91、15.69、11.21 mg/100 g，一次浸渍样品中含量最低，其他样品间差异显著（P＜0.05）。虽然各样品中AMP的含量较低，但研究表明，AMP与IMP、谷氨酸和天冬氨酸有协同增鲜的作用[14-15]。Hx呈苦味，上海熏鱼中其含量比生鲜鱼肉降低了68.34%，表明上海熏鱼加工方式可改善草鱼的苦味。IMP在生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中的含量分别为215.91、270.20、384.93、370.11、284.56 mg/100 g，生鲜油爆＞一次浸渍后油爆＞上海熏鱼＞一次浸渍＞生鲜鱼肉，生鲜鱼肉IMP的TAV为8.64，其他样品的TAV均有所增加，表明各样品的IMP对呈味都有重要贡献。其原因主要是鱼类死后，ATP的降解顺序依次为ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx[16]；核苷酸在中性条件下稳定性较好，酸性或碱性条件稳定性较差[17]，料酒可改变鱼肉的pH值[18]，促进ATP降解；呈味核苷酸作为增鲜剂添加到酱油中[19]；样品含水量越高核苷酸耐热性越差[17]，邱霞琴等[20]有相似的研究，发现加热草鱼肉15 min后仅ATP含量显著下降，IMP含量显著增加，表明高温可以促进ATP降解，IMP快速积累。研究表明IMP具有强烈的鲜味[21]，故IMP是不同阶段主要的鲜味核苷酸。

2.2 不同加工阶段上海熏鱼的游离氨基酸分析

由表2可知，生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中游离氨基酸分别为396.94、421.02、517.03、560.11、585.79 mg/100 g，呈味氨基酸比依次为28.33%、38.66%、32.69%、44.90%、50.09%，呈显著性上升趋势；上海熏鱼（二次浸渍）中味道愉悦的呈味氨基酸比生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆和一次浸渍后油爆样品分别提高了36.46%、15.39%、58.49%、76.81%。如表3所示，各加工各阶段呈味氨基酸（除脯氨酸）的TAV与生鲜鱼肉相比均呈显著性上升趋势，天冬氨酸和谷氨酸在一次浸渍后油爆和上海熏鱼的TAV大于1，且在上海熏鱼中分别达到最大值2.73和21.46，其他阶段虽TAV小于1，但均显著性高于生鲜鱼肉，表明浸渍和油爆后鱼肉的鲜味得以显著性提高。其原因是首先料酒中的乙醇破坏草鱼鱼肉中的蛋白质结构，然后调味料如料酒、盐、葱、姜汁等在乙醇的引导下也顺利地进入到原料内部，加速蛋白质水解，从而促进氨基酸溶出[18]。生抽酱油中的游离氨基酸进入到鱼肉内部，鱼体自身的组织蛋白在分解作用以及高温环境下氧化降解[22]。组氨酸呈苦味[23]，上海熏鱼中其含量比生鲜鱼肉降低了27.94%，主要原因是鱼肉中存在醛类化合物，而组氨基酸可与还原性化合物进行强烈的美拉德反应[24]。浸渍和油爆有助于提高游离氨基酸总量和呈味氨基酸含量，从而显著性提高鱼肉鲜味，浸渍对鱼肉风味贡献更为显著，浸渍和油爆对鱼肉风味有协同作用。

表2 不同加工阶段上海熏鱼游离氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids of Shanghai smoked fi sh at different processing stages mg/100 g

表3 不同加工阶段上海熏鱼呈味氨基酸TAVTable 3 Taste activity value of fl avor amino acids of Shanghai smoked fi sh meat at different processing stages

2.3 不同加工阶段上海熏鱼的挥发性物质分析

表4 不同加工阶段上海熏鱼挥发性物质的相对含量Table 4 Relative contents of volatile components of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

续表4

续表4

续表4

续表5

生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中挥发性物质分别为36、75、34、73、78种（表4），主要由醛类、酮类、醇类和烃类构成，以及少量的醚类、含氮类、酸类、酯类、芳香族类和其他化合物。3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、己醛、庚醛、苯乙醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、右旋柠檬烯、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-正戊基呋喃是上海熏鱼的主要关键风味化合物（表5）。鱼肉的挥发性风味成分主要由醛类、醇类、烃类、吡嗪类和呋喃类物质组成，对草鱼肉风味形成具有重要贡献。

表5 不同加工阶段上海熏鱼肉挥发性物质的ROAVTable 5 Relative odor activity values of volatile components of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

2.3.1 醛类和酮类

生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中醛类分别为8、14、9、11、12 种，相对含量分别为37.32%、5.85%、45.18%、29.39%、24.56%；酮类分别为2、2、3、4、4 种，相对含量分别为6.67%、0.36%、23.05%、2.48%、2.47%（表4）；显然，生鲜鱼肉中醛酮类含量显著高于一次浸渍，主要是因为鱼肉自身或一次浸渍液中醛类、氨基酸和糖被还原，以及脂肪酸酶促氧化为醇类[25]；生鲜油爆中醛酮类含量最高，后两个阶段均显著下降，主要是因为羰基化合物（醛、酮）是由鱼肉的脂肪酸氧化生成，高温可加速脂肪酸氧化降解[26-27]，鱼肉或浸渍液中氨基酸和糖被还原。

己醛、庚醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是鱼类典型的腥味物质[8,28-30]，己醛、庚醛和壬醛分别在浓度适宜时呈青草、果子和草香气味，浓度较高时呈酸败味、鱼腥味或脂肪味，阈值分别为4.5、2.8、1 μg/kg[8,28-29]，各阶段均显著低于生鲜鱼肉，表明浸渍和油爆可有效改善腥味等不愉快的风味，各样品ROAV大于1，表明对鱼肉风味具有重要贡献。(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛分别呈脂肪味[8]和鸡油味[30]，前者各阶段含量均显著性低于生鲜鱼肉，后者在生鲜油爆和一次浸渍后油爆中含量显著性高于生鲜鱼肉，其他阶段均显著低于生鲜鱼肉，两者对风味具有重要贡献（表5），主要原因是香辛料的掩蔽作用掩盖了那些不受欢迎的异味，或香辛料的有机成分与腥味成分发生了某些化学反应[31]。Özyurt等[32]发现(E,E)-2,4-癸二烯醛在油炸样品中大量检出，主要来源于亚油酸甲酯氢过氧化物的自动氧化[3]，表明油爆促进了脂肪酸的氧化，这与本实验结果一致。癸醛呈甜香和柑橘香气[33]，各样品均被检出，苯乙醛呈浓郁的玉簪花香气，生鲜鱼肉中未检出，其他阶段均被检出，两者对上海熏鱼风味有重要贡献。苯甲醛呈坚果香、杏仁香和果香味[34]，在油爆后被检出，对风味形成有一定的修饰作用，加热是其产生的重要条件[34]。3-甲基丁醛和2-甲基丁醛呈果香味，在一次浸渍后油爆和上海熏鱼中检出，对鱼肉的风味形成有一定贡献。研究表明，二酮类是美拉德反应的初级阶段产物[28]，具有肉香味，2,3-辛二酮在油爆后样品中检出，故推测油爆过程中发生了美拉德反应。各样品中醛类的种类较多，相对含量较高，对鱼肉整体风味形成具有重要贡献，酮类则相反，油爆是脂肪氧化降解的重要条件，加工后的草鱼肉，腥味得以改善，特征风味得以丰富。

2.3.2 醇类和烃类

生鲜草鱼、一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆草鱼和上海熏鱼样品中醇类分别为7、19、4、9、12 种，相对含量为39.56%、56.63%、7.39%、10.39%、6.83%；烃类分别为11、24、9、24、19 种，相对含量为9.38%、23.94%、14.98%、30.29%、12.99%（表4）。一次浸渍中醇类的种类和相对含量均最高，生鲜鱼肉醇类含量次之，其他阶段醇类的含量均显著性降低，但上海熏鱼醇类的种类较为丰富；主要原因：1）醇类主要来源于醛类物质、氨基酸和糖的还原以及脂肪酸酶促氧化等[25]，如一次浸渍中己醇相对含量约24.89%；2）后3 个阶段油爆促进醇类氧化为醛酮类物质；3）生鲜鱼肉中1-辛烯-3-醇相对含量约22.92%，呈蘑菇香和泥土的气味，导致鱼肉具有较重的泥土味[35]，各加工阶段含量均显著低于生鲜鱼肉，上海熏鱼中含量最低，表明泥土味得以改善。一次浸渍、生鲜油爆、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中烃类的含量显著性高于生鲜鱼肉，尤其是萜类含量显著提高，表明调味辅料和油爆是烃类的重要来源，主要原因是：1）蒎烯、莰烯、β-甜没药烯、姜烯和冰片是生姜精油的主要成分[36-37]，3-蒈烯、古巴烯和石竹烯是胡椒的主要成分[38]，这与本实验检出结果一致；2）烷烃主要来自脂肪酸烷氧自由基的均裂[10]，油爆促进了脂肪酸的烷氧化。蒎烯呈清香、樟脑香和松木香，莰烯、姜烯和冰片呈松木香和樟脑香，β-甜没药烯呈木香，β-蒎烯呈树脂和松脂香气[39]，3-蒈烯呈辛辣味，古巴烯呈辛辣味，石竹烯呈木香、柑橘香与丁香香气[38]，均对鱼肉风味具有一定贡献。右旋柠檬烯呈鲜花香气，可进一步氧化生成醛酮醇类化合物，是风味化合物潜在的前体物质[39]，各加工阶段均显著性高于生鲜鱼肉，对鱼肉风味有一定贡献。饱和醇类的阈值很高，对鱼肉风味贡献很小，而不饱和醇类的阈值相对较低，对样品总体风味形成具有一定贡献[40]。研究表明调味辅料和油爆是烃类形成的重要来源，对风味形成有一定贡献。

2.3.3 含硫、含氮类和醚类

含硫化合物仅在一次浸渍、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中检出，一次浸渍种类最多，含量最高，表明其主要来自调味辅料。研究表明，硫化丙烯、甲基烯丙基硫醚和二烯丙基硫醚等含硫化合物是大蒜和洋葱等原材料重要的香味物质，呈大蒜味、洋葱味和辣根味，是烹调时去腥、脱臭和调味的重要调味品[41]，这与本实验研究结果一致。一次浸渍后样品均检出二甲醚，呈轻微醚香气味，4-烯丙基苯甲醚呈大茴香似香气，是五香粉的主要成分之一[42]。各样品中含氮化合物主要是吡嗪和吡咯，仅在油爆后样品检出，上海熏鱼中含氮物质种类最多，高达8种，表明美拉德反应需要在一定加热条件下发生，二次浸渍中添加生抽酱油和白砂糖也参与了美拉德反应。研究表明，吡嗪类化合物是美拉德反应的产物，常在加热过程中产生，呈浓烈的坚果和烘烤香气[28]。本实验检出的2-乙酰基吡咯呈烤香和焦甜香[28]，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪对上海熏鱼的风味贡献显著，丰富了鱼肉的风味成分。

2.3.4 芳香族和其他

各样品中芳香族会使鱼肉呈不愉快的风味[28,43]，其加工后含量均显著下降，表明鱼体令人不悦的风味得以改善。研究发现本实验检出的甲苯、对二甲苯、甲氧基-苯基肟、1,2,3,4-四甲苯、萘和2-甲基萘是从受污染的环境中富集到鱼体内，表明鱼类的生长环境会影响到其风味[28,43-44]。一次浸渍后检出的茴香脑和丁香酚，前者呈甜味和茴香香气，是胡椒粉和五香粉的主要成分之一[38,42]，后者呈强烈的丁香香气，是胡椒粉的主要成分之一[42]，对上海熏鱼风味贡献显著。酸类和酯类的种类相对很少，阈值较高，含量也较低，故对风味形成贡献较小。在一次浸渍、一次浸渍后油爆和上海熏鱼中均检出2-甲基丁酸甲酯，呈苹果和郎姆酒香味[18]，阈值仅为0.25 μg/kg，对鱼肉风味贡献显著。2-正戊基呋喃阈值仅为5.8 μg/kg，呈果蔬香味[45]，加工阶段呈显著上升趋势，可作为肉品脂质氧化的指示物[45]，对鱼肉风味贡献显著。

3 结 论

不同加工阶段草鱼的呈味核苷酸、游离氨基酸、呈味氨基酸和挥发性物质含量均显著性增加，鱼体腥味得以明显改善。浸渍是改善腥味和丰富风味的重要条件，不同辅料对风味均有重要贡献。油爆加速了脂肪氧化降解，加热是美拉德反应的必要条件，通过研究上海熏鱼在不同加工阶段的风味变化，可丰富淡水鱼风味化学的理论知识和为淡水鱼的深加工提供理论支持。