菊粉对小麦面筋蛋白理化性质的影响

穆婉菊，冯 佳，李秀秀，李书红,2，陈 野,*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津科技大学新农村发展研究院，天津 300457）

菊粉存在于洋姜和菊苣中，主要作为一种储存碳水化合物，可以成为人类日常饮食的一部分[1-2]。菊粉是由D-呋喃果糖分子以β-(2→1)糖苷键连接而成的末端有一个葡萄糖残基的果聚糖，聚合度通常为2～60。根据聚合度不同，可以将菊粉分为长链菊粉、天然菊粉和短链菊粉[3]。菊粉具有多种生理功能，如改善肠道微环境、控制血脂、低热量控制体质量、促进矿物质吸收、促进维生素合成、调节血糖水平和抗癌效果等[4-6]。由于其良好的生理功能和理化性质，菊粉常被用作一种益生元、脂肪替代品、糖替代品、质地修饰剂以及功能性食品，可以改善人体健康状况[7-8]。

目前，在面粉工业中，各种膳食纤维，如大豆纤维、麦麸纤维、米糠纤维、燕麦纤维、壳聚糖纤维和果蔬纤维等已被应用于面包、饼干、蛋糕、馒头和面条中[9-10]。然而，限制膳食纤维在面粉中被广泛应用的最主要原因是这类常见的膳食纤维绝大多数水溶性低，粒径粗大，色泽和食品加工性能差，即使低添加量也会给最终产品品质带来严重的不良影响，尤其是在口感、色泽和质构特性等方面[4]。与传统的膳食纤维相比，菊粉在面制品中的应用具有自身的优势。目前，将菊粉应用于面制品中的基础性研究鲜有报道。面筋蛋白作为面制品中的重要组分，通过对其性质的基础性研究可以更好地了解菊粉对面制品品质的影响。

小麦面筋蛋白是从小麦面粉中经过分离、提取和干燥得到，其含蛋白质高达80%以上[5]。小麦面筋蛋白主要由麦谷蛋白和醇溶蛋白组成，麦谷蛋白与面筋弹性有关，而醇溶蛋白与面筋的黏性有关[13-15]。小麦面筋蛋白的质量影响着小麦面团黏弹性和加工品质，因此对其性质的研究具有十分重要的意义[6]。本研究将菊粉加入到小麦面筋蛋白中，对面筋蛋白乳化特性、热特性和结构特性进行研究并对其性质变化与结构之间的关系进行深入探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然菊粉（纯度＞90%） 重庆骄王天然产物股份有限公司；面筋蛋白 郑州市豫香食品发展有限公司。

三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、乙二胺四乙酸二钠、尿素、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸（均为分析纯） 天津市北方天医化学试剂厂。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂；FD-10冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；DSC-60A差示扫描量热仪 日本岛津有限公司；TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪、JSM-IT300LV扫描电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 菊粉和小麦面筋蛋白复合物的制备

每个样品干质量为10 g，将不同质量的菊粉充分溶解于20 mL蒸馏水中，加入面筋蛋白分散于溶液中，使得菊粉添加量分别为0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%和20%。混合物在40 ℃保温2 h，以此来模拟在面团中的反应。反应充分的混合物进行冷冻干燥处理24 h，取出后研磨成粉末，过100 目筛。

1.3.2 蛋白质乳化特性的测定

取0.5 g样品分散于20 mL蒸馏水中，振荡30 min，4 000 r/min离心15 min。取上清液15 mL加入大豆油5 mL，高速剪切10 000 r/min均质1 min。制备好的乳状液分别于0 min和10 min时从乳液底部吸取500 μL，加入到5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠溶液中，混合均匀后用紫外-可见分光光度计在波长500 nm处测定吸光度A0和A10，以0.1%十二烷基硫酸钠溶液作为对照。乳化活性和乳化稳定性分别按式（1）、（2）计算：

式中：N为稀释倍数；θ为油相体积/mL；L为比杯厚度/cm；C为蛋白质质量浓度/（g/mL）。

1.3.3 蛋白质热力学特性分析

采用差示扫描量热法对不同菊粉添加量的小麦面筋蛋白进行热力学特性分析。称取3 g左右的样品放入固体坩埚中，以空坩埚作为对照，放入差示扫描量热仪进行测量。所有测量过程都以10 ℃/min的速率进行加热，从30 ℃升温至160 ℃，均重复进行3 次。

1.3.4 蛋白质巯基及二硫键的测定

溶液的配制：磷酸盐缓冲液：取4 g NaCl、0.1 g KCl、0.71 g Na2HPO4和0.135 g NaH2PO4充分溶解于蒸馏水中，并将其定容至500 mL，pH值为7.4。Tris-Gly-Urea缓冲液：取5.209 g三羟甲基氨基甲烷、3.378 g甘氨酸、0.7445 g乙二胺四乙酸二钠和240.24 g尿素充分溶解于蒸馏水中，并将其定容至500 mL，pH值为8.0。Tris-Gly缓冲液：取10.418 g三羟甲基氨基甲烷、6.756 g甘氨酸和1.489 g乙二胺四乙酸二钠充分溶解于蒸馏水中，并将其定容至1 000 mL，pH值为8.0。Ellman试剂：将20 mg DTNB溶解于5 mL Tris-Gly缓冲液中。

自由巯基的测定：将60 mg样品分散于1 mL磷酸盐缓冲液中，向混合体系中加入5 mL Tris-Gly-Urea缓冲液后充分振荡，再加入50 μL Ellman试剂后避光静置1 h，随后3 000 r/min离心10 min。取上清液用紫外分光光度计在波长412 nm处测量吸光度（A412nm）。按式（3）计算自由巯基含量：

式中：7 3.5 3为E l l m a n试剂的摩尔消光系数/（mol/mL）；D为稀释倍数；C为蛋白质质量浓度/（mg/mL）。

总巯基测定：即称取样品120 mg分散于2 mL磷酸盐缓冲溶液中，加入4 μLβ-巯基乙醇处理2 h后，加入4 mL 12%三氯乙酸溶液静置1 h后，10 000 r/min离心20 min。用12%三氯乙酸溶液洗涤沉淀3 次，每次洗涤后10 000 r/min离心10 min。去除上清液，加入2 mL Tris-Gly缓冲液和80 μL Ellman试剂，进行剧烈振荡后25 ℃静置1 h，10 000 r/min离心30 min。以不加Ellman试剂为对照，取上清液稀释10 倍后测定波长412 nm处吸光度。总巯基含量计算同式（3），并按式（4）进行二硫键含量计算：

1.3.5 蛋白质二级结构分析

使用傅里叶变换红外光谱仪对蛋白质二级结构进行分析，准确称量1 mg样品，将150 mg溴化钾与样品混合，充分研磨使其混合均匀。随后混合物被压缩并放置在红外分析仪上，以4 cm－1的分辨率记录红外光谱，扫描次数为16 次。所有测量均重复进行3 次。

傅里叶变换红外光谱图的处理：利用软件OMNIC 8.0进行分析，首先进行基线校正，然后傅里叶自去卷积，选择合适的峰宽（24～26）和增强度（2.9～3.1），进行高斯函数找峰，拟合峰处理直至峰特征稳定，确定各子峰与各二级结构的对应关系，计算各子峰面积的相对含量。

1.3.6 蛋白质网络结构分析

使用扫描电子显微镜观察蛋白质的网络结构。将冷冻干燥后的样品破碎，使用双面胶将蛋白冻干样的断面朝上，固定在样品台上，使用溅射涂布机对样品的断面进行喷金处理使样品导电，观察断面的微观结构。放大倍数为150 倍。

1.4 数据处理

采用Origin 8.0软件处理数据作图；采用SPSS 22.0统计软件进行相关性分析和方差分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 菊粉添加量对小麦面筋蛋白乳化特性的影响

图1 菊粉添加量对蛋白质乳化活性（A）和乳化稳定性（B）的影响Fig. 1 Effects of inulin on emulsifying activity index (A) and emulsion stability index (B) of wheat gluten protein

小麦蛋白的乳化活性与面制品的柔软度有关，蛋白质的乳化活性越大，其三维网络结构越稳定，因此乳化活性可影响最终面制品的口感[7]。如图1A所示，菊粉的添加显著增加了蛋白质的乳化活性，这是由于菊粉有较强吸水性，改变了蛋白质内部水分分布，破坏了蛋白质分子间的静电斥力，促进蛋白质中疏水基团相互作用，使蛋白质乳化活性增强。另一方面，菊粉的添加可以加强蛋白质分子侧链基团与水相互作用，使蛋白质溶解度增加，从而使乳化活性增强。当菊粉添加量低于10.0%时，随着菊粉添加量的增加，蛋白质乳化活性升高，提高14.4%。当菊粉添加量继续增大，即菊粉添加量超过10%时，菊粉吸水能力达到饱和，对蛋白质溶解度的影响很小，因此对乳化活性影响也较小。

如图1B所示，与乳化活性结果类似，低添加量菊粉对乳化稳定性的影响较为显著，尤其当菊粉添加量为7.5%时，蛋白质乳化稳定性提高了18.7%。有研究表明菊粉可提高麦醇溶蛋白的乳化稳定性但是会降低麦谷蛋白的乳化稳定性，但菊粉对小麦蛋白乳化稳定性的影响中麦醇溶蛋白起主导作用[8]。本研究得到相同的结果，菊粉可提高小麦蛋白的乳化稳定性，此作用尤其在菊粉添加量较低时更为明显。

2.2 菊粉添加量对小麦面筋蛋白热力学特性的影响

表1 菊粉添加量对小麦蛋白热力学特性的影响Table 1 Effect of inulin on thermodynamic property of wheat gluten protein

蛋白质变性过程中会涉及吸热反应和放热反应，焓变值代表反应过程中吸放热情况，焓变值的大小决定蛋白质变性的程度，而变性温度可以反映小麦蛋白的热稳定性[9]。如表1所示，纯小麦蛋白的热变性温度为79.32 ℃，随着菊粉添加量的增加，小麦蛋白的热变性温度升高，当添加量为12.5%时达到最大值，变性温度为（90.29±1.17）℃。这说明添加菊粉可以提高蛋白质的热稳定性，可能是由于菊粉侧链大量羟基，与蛋白质的亲油基团通过氢键作用形成紧密的结构造成的。有研究也得到多糖可以改善蛋白质热稳定性的相关结论[10]。

小麦蛋白的焓变值在添加菊粉时逐渐下降，但当菊粉添加量较低时，焓变值的变化并不显著，当添加量为12.5%时，焓变值显著降低。本实验中菊粉加入到蛋白质中进行热处理，导致美拉德交联反应的发生，最终使焓变值降低。

2.3 小麦面筋蛋白巯基及二硫键含量测定

二硫键可使蛋白质肽链空间结构更加紧密，网络结构更加稳固，相反，二硫键断开会造成蛋白质黏度下降，影响食品加工过程中面制品的品质[21-22]。蛋白质中的二硫键可以经过还原反应形成巯基后，蛋白质构象将变得松散，但在一定条件下自由巯基经重新氧化，又可重新形成二硫键，二硫键可按照原来的配对进行组合，这样形成的蛋白质可与天然蛋白质一样，既有正确的空间构象，又具有原来蛋白质的生物活性。

表2 菊粉添加量对小麦蛋白自由巯基及二硫键含量的影响Table 2 Effect of inulin on disulfide and free sulfhydryl contents of wheat gluten protein

如表2所示，随着菊粉添加量的增加，蛋白质自由巯基含量下降，二硫键含量增加，当菊粉添加量达到20%时，蛋白质自由巯基含量下降了67.73%，二硫键含量增加了2.22 倍，这些变化都表明自由巯基正逐步向二硫键结构转化。在满足二硫键形成的化学条件下，二硫键的形成原本是一个随机的过程，但菊粉的加入可能会加大这种随机事件的概率，导致蛋白质二硫键进一步形成。菊粉应用于面制品加工中，可对面团柔韧性有积极影响。

2.4 菊粉添加量对小麦面筋蛋白二级结构的影响

蛋白质二级结构是由多种力共同维持的，其中最重要的作用力是氢键，傅里叶变换红外光谱对氢键强度十分敏感，因此常作为分析蛋白质二级结构的方法[11]。傅里叶变换红外光谱图中酰胺I带不同的吸收波数分别对应着蛋白质二级结构中的α-螺旋结构（1 650～1 660 cm－1）、β-转角结构（1 660～1 700 cm－1）、β-折叠结构（1 610～1 640 cm－1）和无规卷曲（1 640～1 650 cm－1）[12]。

小麦蛋白二级结构中的α-螺旋结构是一个稳定牢固的弹性结构，它与面制品的品质有关，主要影响面团的弹性和硬度[13]。如表3所示，添加菊粉对小麦蛋白α-螺旋结构相对含量影响不显著。随着菊粉添加量增加，小麦蛋白β-折叠结构和无规卷曲相对含量升高，β-转角结构相对含量降低。由于菊粉强大的吸水性，导致整个体系中自由水减少，这种水合环境的改变最直接的结果就是导致维持β-转角结构的氢键被破坏，使β-转角结构所占比例降低。同时，菊粉的存在还使一些小分子蛋白在非共价相互作用下发生聚集，导致β-折叠结构增多。有研究也得出相似结论，新形成的β-折叠结构属于反平行β-折叠结构[14]。由于菊粉可以与水分子形成氢键，使得体系中水分结合的更加紧密，进而使C＝O与水形成的氢键增强，小麦蛋白中无规卷曲结构比例也随之增加[15]。

表3 菊粉添加量对小麦蛋白二级结构的影响Table 3 Effect of inulin on secondary structures of wheat gluten protein

2.5 菊粉添加量对小麦面筋蛋白微观结构的影响

图2 菊粉添加量对蛋白质微观结构的影响Fig. 2 Effect of inulin on microstructure of wheat gluen protein

从图2可以看出，不添加菊粉的小麦蛋白结构存在孔隙，随着菊粉的加入，孔隙逐渐消失，结构逐渐致密。添加菊粉后的面筋网络结构更加稳定，这与蛋白质乳化活性增强有关，菊粉的添加使面筋蛋白中麦醇溶蛋白亲水作用增强，这使面筋网络结构得到强化。可以观察到添加10%菊粉的面筋蛋白网络结构最致密，这与菊粉添加量为10%时，蛋白质乳化活性较强的实验结果相一致。另外，面筋蛋白中二硫键含量的增加也是造成面筋蛋白网络结构更加稳固的原因。

当菊粉添加量达到7.5%时，可以观察到菊粉附着到面筋蛋白表面上，随着菊粉添加量进一步增加，覆盖程度也进一步加强。当菊粉添加量达到20%时，显微图像中已经基本观察不到孔隙的存在。菊粉与蛋白质间存在着氢键和疏水键，这些局部作用力在2 种物质边界处起到连接作用[16]。菊粉和某些蛋白质如酪蛋白和β-乳球蛋白的疏水作用还可在溶液中形成一个具有疏水中心的螺旋旋涡，这也可能对蛋白质的微观结构产生一定影响[29-30]。

3 结 论

本实验研究了不同菊粉添加量对小麦蛋白多种理化性质和结构性质的影响。菊粉可改善小麦蛋白乳化性能，较低添加量的菊粉对小麦蛋白乳化性能的影响较显著；小麦蛋白的热变性温度在添加菊粉之后升高，焓变值降低，在一定程度上说明菊粉可以提高小麦蛋白热稳定性；蛋白质中自由巯基与二硫键之间可通过一系列氧化还原反应相互转化，随着菊粉添加量的增加，蛋白质中自由巯基逐步向二硫键结构转化，这使得蛋白分子空间结构更加紧密；对于蛋白质二级结构而言，菊粉对小麦蛋白中α-螺旋结构所占比例影响不显著，但会使蛋白结构中β-折叠结构和无规卷曲所占比例升高，β-转角结构相对含量比降低；对于蛋白质微观结构而言，菊粉使蛋白网络结构更加致密和稳定。总之，菊粉可以改善蛋白质多种理化性质，此研究为后续菊粉作为一种膳食纤维添加到面制品的研究中提供了理论支持。