视黄醇结合蛋白胶乳增强免疫比浊检测方法研究

李海剑 张婷婷

1河南省食品药品审评查验中心 （河南 郑州 450003）2河南省食品药品检验所 （河南 郑州 450003）

内容提要： 建立胶乳增强免疫比浊测定血清视黄醇结合蛋白的全自动分析方法。采用胶乳增强免疫比浊测定视黄醇结合蛋白，测定其准确度、线性、精密度等，并与同类产品对比测定临床样本。此方法批内精密度CV值为2.3%；批间相对极差为3.5%。线性范围可达140mg/L。与其他相关试剂比较γ=0.999。本试剂方法简便，结果准确，线性范围宽，稳定，价格低廉，完全可用于检测临床标本。

视黄醇结合蛋白（RBP）是体内一类将视黄醇从肝中转运至靶组织以及实现视黄醇的细胞内转运代谢的特异性的运载蛋白[1]。以视黄醇和蛋白结合的形式存在，一旦复合物中的视黄醇和靶细胞结合，极有可能导致RBP和蛋白分离，由肾小球滤出或肾小管细胞吸收。测定RBP的含量，对肝脏、肾脏及营养状况等疾病的诊断和治疗有着重要意义[2,3]。目前临床上，RBP检测有以下方法：放射免疫分析法、免疫电泳法酶联免疫吸附分析法和免疫比浊法[4-6]。本文建立的是胶乳免疫比浊法，通过把抗体包被到胶乳颗粒上配制成液体试剂，将免疫学方法很好地运用到全自动生化分析仪上，是一种方便实用高效的自动化分析方法。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试剂：①试剂R1：磷酸盐缓冲液。②试剂R2：磷酸盐缓冲液、包被抗人RBP抗体乳胶颗粒悬液。③对照试剂：市销RBP试剂盒（胶乳免疫比浊法)。④参考品：参考品1，3.0mg/L；参考品2，138.8mg/L。

仪器设备：日立全自动生化分析仪。

1.2 方法

终点法，波长600nm，反应温度37°C，标本3μL，试剂Rl 225μL，试剂R2 75μL，反应时间300s。

表1.准确度测定结果

2.结果

2.1试剂Rl缓冲液确定

选三种缓冲液实验，其他条件不变，测定138.8mg/L参考品，Tris缓冲液结果在参考品值范围内但明显偏高；枸橼酸缓冲液结果不在参考品值范围内。磷酸盐缓冲液结果接近参考品且重复性很好，故选用磷酸盐缓冲液。

2.2磷酸盐缓冲液pH的确定

选五种不同pH（pH6.2、6.8、7.2、7.8、8.2）磷酸盐缓冲液实验，其他条件不变，测定138.8mg/L参考品，pH低时测定结果偏低，pH高时结果偏高，pH7.2时结果最为理想，故磷酸盐缓冲液pH确定为7.2。

2.3试剂R2包被抗人RBP抗体乳胶颗粒悬液最佳浓度选择

选5种不同包被抗人RBP抗体胶乳颗粒悬液浓度（0.05、0.10、0.15、0.2、0.25mL/L）实验，其他条件不变，测定138.8mg/L参考品，浓度低时测定结果偏低，浓度高时结果偏高，浓度为0.15mL/L时结果最为理想，故试剂R2包被抗人RBP抗体乳胶颗粒悬液最佳浓度0.15mL/L。

2.4准确度

测定参考品1、2，重复检测3次，取均值，计算相对偏差，见表1。

2.5精密度确定

测定参考品138.8mg/L重复10次，计算均值及精密度，其结果批内精密度CV为2.3%；批间相对极差为3.5%。

2.6线性范围测定

用接近线性区间下限的样品稀释接近线性区间上限的高浓度样品，得5个稀释浓度，每个浓度测试3次，取平均值进行回归分析。结果表明在140mg/L时线性良好，见表2。回归方程：y(测定值)=1.0633x(理论值)-2.2078，相关系数为0.9991。

表2.线性测定结果(mg/L)

2.7 方法学评价

研发试剂和对比试剂双份测定42份样本，计算P和相关系数r。结果P=0.34（＞0.05），两种检测结果的量值无显著性差异；r=0.999（＞0.975），两组测试数值具有显著性正线性相关关系。

2.8 试剂稳定性观察

试剂置2～8°C保存，0、1、2、6、12、13个月各检测一次，其准确度、批内精密度、线性等均无明显变化。

3.讨论

本试剂采用胶乳免疫比浊法，将RBP抗体吸附于胶乳颗粒表面，样本中的RBP与胶乳颗粒上吸附的抗体结合成抗原抗体复合物，从而产生浊度变化，该浊度变化的高低与样本中RBP的含量成正比。通过测定600nm处吸光度的变化，即可得出RBP的含量。

该方法仅在全自动生化分析仪上就可以进行测定，操作简单，无需其他特殊的设备，线性范围较宽，准确度高，较稳定等，是RBP理想的测定方法[7]。