蓬莪术乙醇提取物的抗IBV作用研究

向谈婷，刘卫荣，彭小琴，高中南，方守国

（长江大学农学院，荆州 434025）

禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是一种正股单链的RNA病毒，属于冠状病毒科（coronaviridae）、冠状病毒属（coronavirus）[1]，能够使鸡患上传染性支气管炎，并且影响鸡蛋的质量，是危害养鸡业的主要病毒病[2]。目前，对于IBV的主要防控手段是疫苗，但由于IBV的血清型众多，使得疫苗免疫效果及安全性无法保证。蓬莪术主要产于四川省、福建省等，研究表明蓬莪术具有较好的抗肿瘤、抗血栓、抗炎症、抗病毒等作用[4]。本研究以rIBV-3ab-Luc及rIBV做供试病毒，探究蓬莪术乙醇提取物对IBV的抑制作用及其对干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和STAT1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）细胞因子的调控作用，为蓬莪术的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Life Technology公司；胰酶购自Gibco公司；DMEM basic（1×）购自赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司；Trizol、荧光素酶试剂盒购自Invitrogen公司；荧光定量试剂（RR047A）购自TaKaRa公司。

1.2 细胞与病毒rIBV-3ab-Luc及rIBV，由方守国教授研究团队构建；H1299细胞，由新加坡南洋理工大学生物学院病毒实验室提供。

1.3 中草药乙醇提取物的制备将蓬莪术磨成粉并称重，用80%乙醇浸泡7 d，浸提液过滤，提取物的初始浓度为0.566 5 g/mL，放入4℃冰箱备用。

1.4 测定最大无毒浓度参照参考文献[5]，使用MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法测定最大无毒浓度。

1.5 荧光素酶测定当细胞密度达到90%时，吸去原培养液，PBS洗2次后，进行下列处理：1）加0.9 mL含有10%FBS的培养液，再加入6 μL提取物混匀。培养24 h后，换无FBS的培养液，并加入100 μL 0.5 MOI病毒；2）加无FBS的培养液，将6 μL提取物与100 μL 0.5 MOI病毒混合20 min后，用其混合液处理细胞；3）加无FBS的培养液，再加100 μL 0.5 MOI病毒，2 h后加入提取物6 μL。吸去培养液，PBS洗2次，加入100 μL细胞裂解液，将细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中，15 185×g离心5 min；取20 μL离心上清液和50 μL底物移至新的1.5 mL离心管中，迅速放入荧光检测仪中检测。

1.6 实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescence quantitative RT-PCR，RT-qPCR）检测IBV感染H1299细胞2 h后，提取物处理被感染的H1299细胞，继续培养16～24 h，收获细胞。按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，超微量核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，-20℃保存。RT-qPCR检测步骤：（1）cDNA合成：按照荧光定量反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20℃保存。（2）qPCR反应：以cDNA为模板，94℃预变性30 s，94℃变性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共40个循环。所用引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 primer sequences

2 结果

2.1 MTT检测结果OD值越大，说明细胞活性越强，如果OD值大小与对照组OD值大小无差异（P＞0.05），不具有统计学意义，表明该浓度对细胞生长无抑制作用。由图1可知，当稀释倍数为0即提取物的初始浓度为0.566 5 g/mL时，其OD值明显小于其他稀释倍数和对照组（P＜0.05），差异具有统计学意义，表明此浓度的药物对细胞生长有抑制。而当稀释倍数为1、2、3、4时，OD值大小与对照组比较，差异不具有统计学意义（P＞0.05），因此确定提取物的最大无毒浓度为0.283 3 g/mL。

图1 MTT法检测最大无毒浓度Fig.1 The maximum toxic concentration determined by MTT assay

2.2 蓬莪术乙醇提取物抑制IBV在细胞内的复制情况荧光素酶检测实验是对靶基因mRNA表达水平进行检测，荧光值越小说明病毒mRNA越少，从而间接地反映出提取物是否对病毒具有抑制作用。由图2可知，3种处理方式中，病毒加药组的荧光值均小于病毒对照组荧光值，差异具有统计学意义（P＜0.05），证实提取物抑制IBV在细胞内的复制。

2.3 RT-qPCR检测干扰素能够与受体结合，激活JAK/STAT信号通路。但是由图3可知，各处理之间IFN-γ表达量无差异，推测可能是IFN-α/β或者其他的细胞因子在发挥作用，来激活JAK/STAT信号通路。STAT1是JAK/STAT信号通路中的一种因子，由图3可知，病毒加药组STAT1表达量显著低于病毒对照组，具有极显著统计学意义（P＜0.01），推测提取物可能通过JAK/STAT信号通路影响病毒在细胞内的复制。IBV-N表达量的差异也具有极显著统计学意义（P＜0.001），证实提取物抑制了IBV在细胞内的复制。

图2 蓬莪术乙醇提取物不同处理方式对IBV的抑制效果Fig.2 Inhibition of IBV by different treatment methods of ethanol extract from Zedoary

图3 RT-qPCR检测细胞因子的表达Fig.3 Expression of cytokines detected by RT-qPCR

3 讨论

蓬莪术是多年生的宿根草本，根茎含挥发油，油中主要成分为倍半萜烯类，具有抗肿瘤、抗早孕、抗凝血、抗炎症、抗菌、抗氧化和保肝等活性[6]。钱伯文教授运用莪术治疗恶性肿瘤[7]，孙涛等[8]发现醋炙蓬莪术具有活血化瘀作用，王茜等[9]发现蓬莪术叶精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌均有抑制作用，夏泉等[10]发现莪术油有抗流感病毒的作用。目前对蓬莪术的研究多集中于对其成分的分离和鉴定及其在抗肿瘤、抗早孕、抗炎症等方面的功能研究，而抗病毒作用及抗病毒作用机理的研究甚少。

本研究采用3种不同的加药方式进行荧光素酶实验，发现3种处理方式中，病毒加药组的荧光值均小于病毒对照组的荧光值，说明提取物抑制了IBV在细胞内的复制。IFN-γ又称为免疫干扰素，是一种高效的抗病毒细胞因子[11]。IFN-γ能与细胞膜上的受体结合激活JAK/STAT信号通路，引起机体的免疫反应[12]。病毒感染细胞后，产生一些抗病毒细胞因子，例如干扰素，与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，使得与受体偶联的JAK激酶活化，进而催化STAT1蛋白发生磷酸化修饰，磷酸化的STAT1蛋白进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。根据RT-qPCR实验结果，发现提取物对IFN-γ没有显著性影响，但是对STAT1具有显著性影响，推测可能是IFN-α/β或者其他细胞因子在发挥作用，来激活JAK/STAT信号通路。关于提取物是否通过JAK/STAT信号通路影响病毒在细胞内的复制，还需进一步的深入研究。本研究结果为蓬莪术作为抗IBV中草药的开发和利用提供理论支持。蓬莪术抗IBV的作用机制仍然需要进一步研究。