DUSP6通过负向调控ERK1/2通路抑制IBV的增值

王 欢 ，丁 铲 ，刘定祥 ，廖 瑛

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.华南农业大学 群体微生物中心，广东 510642）

禽传染性支气管炎（avian infectious bronchitis，IB）是由禽传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种鸡的急性、高度接触性传染性疾病，给养禽业造成了严重的经济损失[1]。根据临床症状不同IB可划分为呼吸型、肾病变型、腺胃型等。IBV属于冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）的γ型冠状病毒。病毒颗粒外有囊膜，内含不分节段的单股正链RNA基因组，具有侵染性，长为27.6 kb，有5'帽子结构和3'polyA尾巴结构。病毒基因组可转录出6条亚基因组mRNA，编码nsp2～nsp16等15个非结构蛋白、纤突蛋白（spike protein）、膜蛋白（membrane protein）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）和小包膜蛋白（envelope protein）4种结构蛋白以及3a、3b、5a和5b四种附属蛋白。IBV感染宿主细胞，先以正链基因组为模板首先翻译出包括蛋白酶、RNA依赖性RNA复制酶和RNA解旋酶在内的nsp2～nsp16，再在复制酶的作用下，以基因组为模板转录负链RNA，进而以负链RNA为模板复制和转录出正链基因组和6条亚基因组mRNA，mRNA翻译结构蛋白，最后组装成成熟的病毒粒子。

病毒进入宿主细胞的增殖受到多种胞内分子的调控。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是其中的一种，它涉及多种细胞过程，包括转录调控、细胞增殖、细胞凋亡、mRNA稳定性、蛋白质翻译和促炎细胞因子的产生等[2]。病毒可以利用这些细胞过程来完成自身蛋白和核酸的复制。在哺乳动物细胞中，MAPK包括3条信号通路：ERK（extracellular signal-regulated protein kinases）1/2通路、JNK（c-Jun N-terminal kinase）通路和p38（p38 kinases）通路。ERK1/2通路由有丝分裂原和增殖刺激因子激活，而JNK和p38通路由环境压力激活。越来越多的证据表明，病毒感染过程利用MAPK通路，帮助自身在宿主细胞中完成自身复制[3-5]。研究报道，肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）感染细胞可激活ERK1/2信号通路，引起免疫学损伤，有利于病毒复制[6]。

MAPK通路在许多细胞过程中发挥重要作用，同样其作用也受到其他分子的调节。双特异性磷酸酶家族（dual specificity phosphatase，DUSPs），是蛋白酪氨酸磷酸酶的一个子类，有11个特征明显的家族成员。目前已发现，该家族的大部分成员都参与负向调节MAPK信号转导活性，从而参与基因转录调控、细胞增殖、细胞凋亡和应激反应[7]，调节生长发育和内环境稳态[8]。研究发现，IBV感染细胞后可通过DUSP1负向调控p38的活性，减少IL-6、IL-8的表达，从而抑制过度炎症反应[9]。DUSP6是MAPK磷酸酶家族的一员，可以针对酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化并使ERK1/2失活[10-11]。

本研究发现IBV感染细胞引起ERK1/2的磷酸化，从而激活MEK/ERK1/2信号通路。在IBV病毒感染过程中，用MEK（MAPK/ERK kinase）1/2抑制剂U0126处理细胞，阻断MEK/ERK信号通路，ERK1/2的磷酸化水平下调，同时抑制了病毒的复制。Northern blot 和Western blot结果显示，IBV感染细胞引起DUSP6的转录和表达水平上调。利用siRNA干扰DUSP6的表达，或者用药物BCI抑制DUSP6活性，均能增强ERK1/2的磷酸化，并且抑制病毒增殖。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞本实验所用的IBV-Beaudette毒株、IBV-N抗体以及Vero细胞均由华南农业大学刘定祥教授赠予。人肺癌细胞系（H1299）购于美国菌种保藏中心（American type culture collection，ATCC）。Vero细胞培养于含10%胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）的DMEM培养基，H1299细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基，均置于37℃、5%CO2培养箱中培养。病毒通过Vero细胞扩增，以0.1 MOI感染细胞24 h后，收取细胞和培养液，反复冻融3次，离心取上清，测定TCID50后，-80℃保存备用。

1.2 主要试剂和抗体Trizol试剂购自Life Technologies公司；氯仿、异丙醇、甲醛购自美国Thermo Fisher公司；乙醇购自上海泰坦科技股份有限公司；逆转录酶AMV购自Roche Diagnostics公司；Oligo dT由金唯智公司合成；地高辛标记试剂盒、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG easy Hyb、Anti-digoxigenin-AP Fab fragments和CDP-Star均购自德国罗氏公司；溴化乙锭试剂购自Bio-Rad中国公司；HybondTM-N+膜、硝酸纤维素膜购自Amersham Biosciences公司；DEPC水、冰醋酸、柠檬酸钠、三（羟甲基）氨基甲烷购自生工生物（上海）股份有限公司；DUSP6、p-ERK1/2、ERK1/2抗体购自CST公司；β-tubulin抗体购自美国Eptiomics公司；抑制剂U0126和BCI购自美国Sigma公司；siRNA由上海吉玛公司合成。

1.3 RNA提取将Vero和H1299细胞分别接种在10 cm培养皿中，待细胞长成单层时接种IBV，IBV感染细胞1 h后，更换新鲜维持液继续培养。在指定的时间点（感染后第0、4、8、12、16、20、24、28 h），用10 mLPBS缓冲液清洗细胞，1 mL Trizol室温裂解5 min。将细胞裂解物转移至干净的EP管，加入五分之一体积的氯仿，振动15 s后温育3 min，然后以4℃、12 000×g离心15 min。取上清水相于干净EP管中，加入等体积的异丙醇混合，置于-20℃冰箱静置30 min，使RNA沉淀。然后以4℃、12 000×g离心15 min，弃上清，用1 mL 70%乙醇溶液洗涤RNA沉淀物2次，每次以4℃、7500×g离心15 min。弃上清后风干沉淀，在70℃溶解于100 μL DEPC水中，-80℃冰箱保存备用。

1.4 探针合成探针cDNA模板制备：混合2 μg RNA和10 μL oligo dT（10 pmol/μL），终体积10.5 μL。65℃变性10 min，冰浴冷却；加入10 mmol/L dNTPs、20 IU RNA酶抑制剂、2 μL 10×反转录酶缓冲液和50 IU反转录酶，终体积为20 μL，置于43℃反应1 h，合成cDNA，再以65℃加热10 min，终止反应。以DUSP6为引物，探针制备：其序列为5'-CCGTCACGGTGACAGTGGCTTA-3'（正向）和5'-CTGCTGTGCGGGGACACGATT-3'（反向），通过PCR扩增获得DUSP6探针。PCR反应体系：32.25 μL ddH2O、5 μL PCR buffer、5 μLPCR DIG labeling mix、5 μL正向引物、5 μL反向引物、0.75 μL enzyme mix、2 μL模板cDNA，终体积为50 μL。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30个循环。72℃延伸7 min。探针制备完成后，置于-80℃冰箱保存备用。

1.5 Northern blot30 μg RNA 65℃变性10 min后加入RNA上样缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后使用半干转仪恒压20V转膜30 min，转膜后1200J紫外交联2 min，然后将杂交膜使用1.4制备的探针68℃杂交过夜，杂交后洗膜并封闭30 min，封闭结束后用DIG抗体（Dilute anti-DIG-AP 1∶10000）孵育30 min，洗膜2次，每次5 min；然后利用CDP-Star系统和Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统检测信号。

1.6 Western blot将Vero和H1299细胞分别接种在6孔板中，待细胞长成单层时接种IBV，IBV感染细胞1 h后，换维持液继续培养。在指定的时间点（感染后第0、4、8、12、16、20 h），分别用1 mL PBS缓冲液清洗细胞。每孔加入200 μL 2×蛋白裂解缓冲液裂解1 min后，收取细胞裂解液于干净的EP管，100℃金属浴8 min，12 000×g离心2 min后，取10 μL上清上样跑胶。恒流250 mA转印90 min，5%脱脂乳室温封闭1 h后，分别孵育p-ERK、ERK、IBV-N、DUSP6和β-tubulin抗体，并孵育相应种属的二抗，显影前避光配制ECL发光显色液，NC膜在ECL发光显色液中孵育30 s后用Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统检测信号。

1.7 U0126抑制实验将Vero和H1299细胞分别接种在6孔板中。待细胞长成单层后接种IBV，IBV感染细胞1 h后，去除未结合的病毒，加入维持液继续培养，并加入不同浓度的U0126或者BCI。感染后12 h用1 mL PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入200 μL 2×蛋白裂解缓冲液，裂解5 min后收取细胞置于干净的EP管。100℃金属浴8 min，12 000×g离心2 min。样品保存于-20℃备用。

1.8 siRNA干扰实验将H1299细胞按照5×105个/孔接种于6孔板，培养至细胞密度达到60%时进行siRNA转染试验。取两个EP管分别加入250 μL的Opti-MEM培养基，其中一个加入5 μL的转染试剂Lipofectamine 2000，另一个EP管加入5 μL 20 mmol/L的siRNA，室温静置5 min。将上述两管轻柔混匀，室温静置20 min，形成siRNA/Lipofectamine 2000复合物。预先铺好细胞的6孔板用预冷的PBS清洗3遍，每孔加入1 mLOpti-MEM培养基，并将siRNA/Lipofectamine 2000复合物加入到6孔板中，混匀，置于37℃、5%CO2培养箱培养4 h后弃上清，加入含1%FBS的RPMI1640培养基继续培养32 h，收取蛋白样品，采用Western blot检测相应蛋白的表达情况以确定干扰效果。

表1 siRNA序列Table1 siRNA sequences

2 结果

2.1 IBV感染引起ERK1/2的磷酸化许多病毒感染都会引起ERK1/2的磷酸化，该信号通路的激活在病毒的感染性复制中发挥一定的作用[12]。本实验以1 MOI的IBV分别感染Vero和H1299细胞，在感染后不同时间点收取细胞裂解液，通过Western blot检测细胞中ERK1/2的磷酸化水平（p-ERK1/2），每个时间点设置模拟感染（无病毒感染）为对照组。如图1所示，跟模拟感染组相比较，随着感染时间变化，Vero和H1299细胞内的ERK1/2蛋白表达量保持不变。然而，ERK1/2的磷酸化水平在感染后4 h开始上调，并随着感染时间的延长逐渐升高，分别在感染后16和20 h时达到顶峰。综上，IBV感染能够激活ERK1/2信号通路。

2.2 U0126抑制IBV-N蛋白的表达为了进一步研究ERK1/2信号通路的激活在IBV感染过程中的作用，先利用药物U0126处理受感染的细胞，再检测病毒增殖情况。U0126是一种MEK/ERK通路特异性抑制剂，通过抑制MEK1/2的活性，抑制ERK1/2的磷酸化。本实验首先用IBV分别感染Vero细胞和H1299细胞，以10 μmol/L或15 μmol/L U0126处理的感染后的细胞为实验组，以溶剂DMSO处理的感染后细胞为对照组，并以模拟感染(无病毒感染)为负对照组。感染后12 h时收取蛋白样品，采用Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平以及IBV-N蛋白表达情况。如图2所示，与负对照组相比，对照组的ERK1/2磷酸化水平明显上调；而与对照组相比，在U0126处理组中，ERK1/2的磷酸化水平下调，即ERK1/2的激活受到U0126的显著抑制，且U0126实验组中IBV-N蛋白表达量比对照组的表达量明显减少，这种减少情况在H1299细胞中尤其明显。综上，U0126能显著抑制ERK1/2的磷酸化，同时也抑制IBV-N蛋白的表达，表明ERK1/2的磷酸化有促进IBV复制的作用。

图1 IBV感染激活ERK1/2信号通路Fig.1 IBV infection activated ERK1/2 pathway

图2 U0126抑制ERK1/2信号通路，抑制了IBV的增殖Fig.2 U0126 inhibits ERK1/2 phosphorylation and IBV proliferation

2.3 IBV诱导DUSP6的表达DUSP6是双特异性磷酸酶家族（DUSPs）的成员，可使ERK1/2通路上的酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化，从而使ERK1/2失活。本研究发现，IBV感染细胞后引起ERK1/2的磷酸化，而MEK激酶抑制剂U0126能够特异性的抑制MEK1/2，阻断ERK1/2通路的激活，抑制IBV的增殖。通常，MAPK通路需要激酶和磷酸酶来调节其活性，从而根据细胞生理需要来调节和平衡相关基因的表达。在Microarray数据中，我们发现DUSP6在转录水平被IBV感染诱导表达，因此，我们预测IBV感染细胞可能会通过促进DUSP6的表达来负向调节ERK1/2通路的活性。本研究采用IBV感染Vero和H1299细胞，收集感染后不同时间点细胞样品，通过Northern blot检测细胞中DUSP6的mRNA水平变化。如图3所示，在Vero细胞中，DUSP6 mRNA在IBV感染后0 h时有少量表达，从感染后4 h时，DUSP6 mRNA信号有明显的上调，并逐渐增强，在感染后16～20 h达到顶峰，感染后24～28 h，由于细胞开始死亡，RNA发生降解（如rRNA开始降解变少），DUSP6 mRNA信号开始减弱，直到消失。在感染H1299细胞4～16 h后，DUSP6 mRNA信号逐渐增强，感染后8 h时达到顶峰，在感染后20～28 h，由于mRNA开始降解（rRNA开始降解变少），DUSP6信号逐渐消失。以上结果表明，IBV感染能促进DUSP6 mRNA的转录。进一步利用Western blot检测IBV感染过程中DUSP6的蛋白表达情况。由于在感染后24 h时细胞死亡，mRNA 降解，因此本研究仅选取感染后0～20 h的时间点做检测，并设模拟感染组做对照。如图4所示，与模拟感染组相比，无论是在Vero细胞还是在H1299细胞中，IBV感染后4 h时，DUSP6蛋白表达水平均开始上升，并持续到感染后20 h。综上，IBV感染可诱导DUSP6蛋白的表达。

图3 IBV感染增强DUSP6 mRNA的转录Fig.3 IBV infection induced DUSP6 mRNA transcription

图4 IBV感染诱导DUSP6的蛋白表达Fig.4 IBV infection induced high expression of DUSP6 protein

2.4 药物抑制DUSP6活性或者siRNA干扰DUSP6表达，均能上调ERK1/2磷酸化水平，并促进IBV增殖采用DUSP6特异性抑制剂BCI处理细胞，抑制DUSP6的磷酸酶活性。IBV感染Vero和H1299细胞后1 h时，去除未结合的病毒，用10 μmol/LBCI处理细胞12 h。以溶剂DMSO处理细胞为对照组，模拟感染组为负对照组。如图5所示，在Vero和H1299细胞中，与对照组相比，在BCI处理组中，DUSP6表达水平下降（BCI处理导致DUSP6表达下调机制尚不清楚），而ERK1/2的磷酸化水平上升，IBV-N表达水平上升。该结果表明，DUSP6发挥着去磷酸化ERK1/2的作用，不利于病毒复制增殖。为了进一步检测DUSP6对ERK1/2信号通路的调控和对病毒增殖的影响，我们针对DUSP6设计特异性siRNA。siRNA转染H1299细胞后36 h，且IBV感染后8 h，Western blot结果（图6）显示，与sic组相比，siDUSP6的3条siRNA单转染，能够抑制DUSP6的表达，而3条siRNA混合转染，能够明显抑制DUSP6的表达。在所有的siDUSP6转染细胞中，p-ERK1/2的水平均有上调，说明DUSP6的表达量与ERK1/2的磷酸化水平呈负相关。在DUSP6基因沉默的细胞中，IBV-N的表达量呈现上调趋势，说明DUSP6的表达，负向调控IBV的复制增殖。综上，通过特异性抑制剂处理或siRNA干扰的方法降低DUSP6的活性或者减少DUSP6的表达，可导致ERK1/2的磷酸化水平升高，进一步促进IBV的增殖，说明DUSP6在病毒感染过程中负向调控ERK1/2信号通路，DUSP6的上调表达不利于IBV的感染和增殖。

图5 DUSP6抑制剂BCI影响IBV-N的表达Fig.5 DUSP6 inhibitor BCI dampened the expression of IBV-N

图6 siDUSP6抑制IBV-N的表达Fig.6 siDUSP6 inhibited the expression of IBV-N

3 讨论

在众多信号转导途径中，ERK1/2通路几乎参与了所有的细胞活动[2,13-14]，因此，ERK1/2能够影响细胞的生理环境。在病毒生命周期的入胞、病毒基因转录、蛋白质表达或子代病毒粒子释放等过程，ERK1/2均发挥重要作用[15-17]。病毒感染细胞激活ERK1/2是一个普遍现象，通常有利于病毒增强自身的感染，例如：ERK1/2因其调节HIV感染性而被定性为病毒相关激酶[18]，ERK1/2的激活是肠道病毒71和痘病毒有效复制所必需的[6,19]。然而，也有研究表明，某些病毒可在细胞ERK1/2磷酸化水平低下时发生病毒感染或持续性感染，例如：单纯疱疹病毒可利用病毒自身编码的Us3丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制ERK1/2的活性调节MAPK信号通路的激活[20]，登革热病毒2型感染细胞不能引起ERK1/2的磷酸化，甚至抑制ERK1/2的活性[21]。因此，针对ERK1/2信号通路，不同的病毒采取了不同的策略，来帮助自身感染。

本研究发现，IBV感染能够激活ERK1/2信号通路，引起ERK1/2的持续磷酸化。用药物U0126抑制ERK1/2的磷酸化，能够明显减少IBV-N的表达，此结果在H1299和Vero细胞中均得到了验证，说明ERK1/2的磷酸化有利于IBV感染和增殖。

双特异性磷酸酶家族（DUSPs），是蛋白酪氨酸磷酸酶的一个子类，属于有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶家族，主要参与反馈性负向调控MAPK型号通路活性[11,22]。在先前的报道中，我们发现DUSP1在IBV感染过程中被上调表达，负向调控p38信号通路，减少炎症因子的产生[9]。此家族的另外一个磷酸酶DUSP6，定位于细胞质中，可以靶向性去磷酸化p-ERK1/2的酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸磷酸基团而使其失活[10-11]。在本研究中，我们发现IBV感染能够促进DUSP6的上调表达。用DUSP6抑制剂BCI抑制其活性，或者用siRNA干扰其表达，降低此磷酸酶的功能，能够导致ERK1/2的磷酸化持续累积，同时有利于IBV病毒蛋白的表达。以上结果说明，在IBV感染过程中，DUSP6的上调表达能够负向调控ERK1/2的活性，且不利于病毒复制增殖，其有可能是宿主细胞的抗病毒反应策略之一。

综上，我们认为ERK1/2是影响IBV感染和复制的胞内信号之一。IBV感染后促进DUSP6的表达，去磷酸化p-ERK1/2，是细胞本身对信号通路的反馈性调节机制，同时发挥抗感染的作用。然而，ERK1/2促进病毒蛋白表达的具体机制，尚不清楚，将是以后研究的方向。