铁皮石斛组织培养研究

杨慧仙

(山西沃成生态环境研究所，山西 太原 030006)

铁皮石斛，兰科石斛属，为多年生草本植物(附生)，最适生长环境具有湿润、凉爽、空气畅通的特点，主要生长于海拔1 600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。铁皮石斛是一种珍贵的中药材，具有滋养阴津、促进消化、提高免疫力，抗疲劳抗氧化，对肠胃病、咽喉疾病、糖尿病、心脑血管病等都有显著疗效[1]。但是铁皮石斛因其本身的种质特点(种子小而无胚乳)，于天然状态下发芽率极低，而在与真菌共生时萌发率较高[2]，并且生长发育缓慢。近年来，随着自然环境的严重破坏、气候变化和人为过度开采导致原生地铁皮石斛已濒临灭绝。铁皮石斛为享誉国际的“药界大熊猫”，早在1987年就已成为三级保护植物(《国家重点保护野生药材物种名录》)，且于1992年作为濒危植物，被录入《中国植物红皮书：稀有濒危植物》[3]，目前，铁皮石斛已成为世界自然保护联盟认定的极度濒危植物[4]。植物组织培养技术是实现植物快速繁殖，人工栽培最快的技术手段[5]。鉴于野生的铁皮石斛非常稀少而且非常昂贵，不适合大众消费，因此，组织培养技术作为铁皮石斛扩繁的关键，已成为解决其资源短缺的最有效途径。为了提高铁皮石斛的繁殖系数，本文以幼嫩的铁皮石斛带节茎段为试验材料，探究不同激素浓度、配比及添加不同种类的植物营养液对铁皮石斛组织培养的影响，以期找到适合铁皮石斛扩繁的最佳培养基配方，以达快繁和工厂化育苗的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛健壮实生苗由山西长治易康园铁皮石斛养殖基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 于生长旺盛、无病害、粗壮的植株上剪取中间茎段(4～8 cm)，肥皂水洗净后剥去茎表皮，流水冲洗1 h后放入超净工作台。依次进行如下步骤：70%酒精消毒(30 s)，无菌水清洗(3次)，0.1%升汞浸泡(3 min，中间摇晃5次)；无菌水冲洗5次；无菌滤纸吸干带芽茎段的表面水分，剪成1.5 cm左右小段后放入无菌培养皿中备用。

1.2.2 诱导培养基的筛选 本试验选取6种诱导培养基进行试验，调节pH为5.8～6.2。培养基配制如下：

(1)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30g·L-1

(2)MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

(6)MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1

每种培养基接20瓶，每瓶接5个茎段。放入培养室(温度25 ℃±2，光照12 h，光照强度为2 000 lx)，以45 d后外植体的生长状况作为结果进行统计记录。

1.2.3 继代培养基的筛选 新芽长成之后，剪成大小均一的带芽茎段(1.5 cm左右)，转接至继代培养基中培养。本试验共设置了4种继代培养基，调节pH为5.8～6.2。培养基配制如下：

(1)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+马铃薯汁100 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+马铃薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每个处理接20瓶，每瓶接5个茎段。放入培养室(温度25 ℃±2，光照12 h，光照强度为2 000 lx)，观察记录，45 d后统计生长状况。

1.2.4 生根培养基的筛选 选取一定高度(>1.5 cm)且生长健壮的幼苗，于生根培养基上培养，培养基的pH调至5.8～6.2。本试验生根培养基设五个处理，分别为：

(1)1/2MS+NAA0.1 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(2)1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(3)1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(4)1/2MS+NAA0.4 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

(5)1/2MS+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1

每个处理接20瓶，每瓶接5个茎段。放入培养室(温度25 ℃±2，光照12 h, 光照强度为2 000 lx)，观察记录生根情况，45 d后统计生根率。

2 结果与分析

2.1 不同激素处理对铁皮石斛嫩茎诱导的影响

如表1所示，不同生长激素的浓度及配比在诱导铁皮石斛嫩茎的发生方面影响显著。选择0.5 mg·L-16-BA时，铁皮石斛生长缓慢，出芽少且部分苗形成愈伤组织。铁皮石斛小苗随6-BA浓度的升高而萌动加快且出芽增多。研究发现，6-BA(1.5 mg·L-1)与NAA(0.5 mg·L-1)结合使用时诱导效果最好(诱导率达到97%)，且铁皮石斛出芽最多、生长茁壮。因此本试验中铁皮石斛的嫩茎诱导的最佳培养基为MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表1 不同激素处理对铁皮石斛嫩茎诱导的影响

2.2 不同培养基对铁皮石斛继代培养的影响

从表2可知：铁皮石斛组培苗在加入活性炭的培养基中的长势整体比不加活性炭的好，且增殖系数较大；培养基中添加了30g/L香蕉汁的铁皮石斛组培苗比添加了100 g·L-1马铃薯汁的出芽少，即增殖系数较小，但苗长得较壮；而在添加了马铃薯汁的培养基中出芽多即增殖系数大，但是苗细长、叶窄。试验结果表明，香蕉汁的壮苗效果优于马铃薯汁，而马铃薯汁的增殖效果明显好于香蕉汁。因此，在对铁皮石斛进行继代培养时，前期可以用培养基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+马铃薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，获得较多的芽，后期将长势较弱的苗转接入培养基MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使苗长得更粗壮。

表2 不同培养基对铁皮石斛继代培养的影响

2.3 不同培养基对铁皮石斛生根培养的影响

在生根培养基中，不同浓度的NAA对铁皮石斛根的诱导效果明显。如表3所示，铁皮石斛生根率随NAA浓度的升高，呈现出先升后降的变化趋势。0.3 mg·L-1NAA处理时，铁皮石斛的生根率最高(达到94%)，且此时培养基中的组培苗长势良好(茎粗壮、主根长而粗、侧根多而壮)。这可能是因为低浓度的NAA，促进铁皮石斛的生根，高浓度的NAA，抑制铁皮石斛生根。因此，本试验中最适合铁皮石斛生根的培养基为：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

表3 不同培养基对铁皮石斛继代培养的影响

3 结论与讨论

试验结果表明，铁皮石斛嫩茎的最佳诱导培养基为：MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。继代培养基可以用MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+马铃薯汁100 g·L-1+ 活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，获得较多的铁皮石斛芽，再将获得的芽转接入MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1蕉汁30 g·L-1+活性炭1 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，使铁皮石斛苗长得更粗壮。最佳的生根培养基是：1/2MS+NAA0.3 mg·L-1+香蕉汁30 g·L-1+蔗糖30 g·L-1。

本试验在培养基中加入了香蕉汁、马铃薯汁以及活性炭，这些物质能够为外植体提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等，对铁皮石斛的增殖和分化有促进作用。香蕉汁的壮苗效果优于马铃薯汁，而马铃薯汁的增殖效果明显好于香蕉汁，这和郜李彬等[6]人的研究结果一致。前人在铁皮石斛培养的不同阶段也曾加入了不同的天然提取液，得到的结果也不尽相同。这可能跟不同的研究人员选取的铁皮石斛品种、外植体类型不同有关。因此要根据具体的品种、外植体类型等实际情况选择铁皮石斛组织培养的培养基配方。