妊娠对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心功能的影响

梁翠 方英伦 赵芳 侯宇希 谢谨捷 马骏 赵丽云

随着我国二胎政策的开放及高龄产妇的增多，妊娠合并心脏的病患呈逐年增多趋势，而妊娠合并肺动脉高压是妊娠期致死率最高的疾病之一。肺动脉高压患者就诊时间较晚，临床孕早中期资料不足，本研究通过超声心动图评估野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠在不同妊娠时期的右心功能，弥补临床资料的不足，为临床诊治该类患者提供参考依据。

材料与方法

1.实验动物及分组 6 周，雌性，SD 大鼠，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，依照首都医科大学附属北京安贞医院实验动物饲养与使用指南，饲养于北京安贞医院实验动物饲养中心。提供充足的食物和水源，饲养环境为24 h 的亮暗光照循环，空气湿度50% ～60%，温度20 ～22 ℃。由于野百合碱注射后大鼠的存活率下降及诱导肺动脉高压大鼠妊娠的成功率较低，故采用随机数字分组法将55 只大鼠不对等分为三组：①肺动脉高压组(A 组，n=18)，②妊娠合并肺动脉高压组(B 组，n=25)，③空白对照组(C 组，n=12)。

2.建立肺动脉高压模型 适应性饲养1 周后，A组和B 组大鼠颈背部注射野百合碱60 mg/kg(MCT Sigma-Aldrich，美国)，空白对照组注射同等容量的盐酸氯化钠溶液。

3.诱导PAH 大鼠 妊娠在注射MCT 2 周后，将B 组雌鼠与雄鼠 2 ∶1 ～3 ∶1 合笼，于每晚 20：00 到早8：00 合笼，早上结束合笼时观察阴栓，观察到阴栓则结束合笼，否则继续合笼，日期不超过3 d。

4.超声监测 观察到阴栓的当天记为妊娠第一天。在 B 组诱导妊娠前 1 天(T0)，妊娠第 3 天(T3)、第 9 天(T9)、第 15 天(T15)对各组大鼠进行麻醉(10%水合氯醛0.3 mL/100 mg)，当翻正反射消失后，胸前区脱毛，仰卧位固定，用小动物超声诊断仪(VisualSonics：VEVO2100)，探头频率为 30 MHz，将取样容积置于肺动脉瓣上测量肺动脉瓣上流速(pulmonary valve velocity，PVV)，对频谱进行分析，测量加速时间(acceleration time，AT)、减速时间 (deceleration time，DT)，加速度 (acceleration speed，AS)，减速度(deceleration speed，DS)，肺动脉内径(pulmonary artery inner diameter，PAID)，主动脉内径(aortic diameter，AD)，右心室游离壁厚度(RVWT)及右心室舒张末期内径(RVEDD)；在主动脉根部大动脉短轴切面测量舒张期主动脉内径(AD)；计算其比值(PAID/AD)。每一超声测定值取3 个连续心动周期测量的均值。

5.体肺循环压力测定 在B 组大鼠妊娠第18天，各组大鼠禁食水12 h 后经10%水合氯醛0.3 mL/100 mg 麻醉，待翻正反射消失后，调整小动物呼吸机(奥尔科特 ALC-V8，上海)潮气量：2 mL，频率50 次/min，吸呼比 1 ∶1，气管切开后行机械通气。后左股动脉穿刺置管(BD Insyte-W 24G，美国)测量股动脉压力(SAP)，开胸后直视下经右心室穿入肺动脉并置管，测量肺动脉压力(PAP)(换能器：Edwards，美国；监护仪：Spacelabs-YZB/USA3926)。

6.统计学方法 实验数据均通过SPSS 24.0 统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差表示，超声测量数据采用重复测量方差分析，成对比较采用LSD 法，股动脉和肺动脉压力采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 法。非正态分布资料采用中位数(M)及四分位数间距(P25，P75)表示。采用Kruskal-Wallis H 秩和检验，两两比较采用Nemenyi法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.动物存活情况 超声各测量时点的动物存活情况如表1。在T18 时间点，麻醉后最后分组情况①A 组(n=9)，②B 组(n=7)，③C 组(n= 11)。除去B 组未妊娠的13 只，在整个研究过程中A 组死亡 9 只，B 组死亡 5 只，C 组亡 1 只。

图1 肺动脉高压大鼠超声测量值； 图2 母鼠子宫内胎鼠

表1 三组大鼠各测量时点的超声指标值[，M(QR)]

表1 三组大鼠各测量时点的超声指标值[，M(QR)]

时间 组别 PVV/(cm/s) AT/ms RVWT/mm RVEDD/mm PAID/mm AD/mm PAID/AD T0 A 组(n=17) 791±112 23.7±2.42 0.429±0.088 3.44±0.838 2.83±0.0754 2.58±0.678 1.10(1.02，1.16)B 组(n=23) 780±73.0 24.8±1.17 0.427±0.051 3.52±0.355 2.94±0.0775 2.67±0.0540 1.11(1.06，1.17)C 组(n=12) 870±97.9 27.3±4.61 0.415±0.053 2.84±0.449 2.62±0.0970 2.80±0.0600 0.97(0.96，1.09)T3 A 组(n=17) 776±72.0 22.8±2.84 0.487±0.102 3.57±0.601 2.96±0.0676 2.59±0.0791 1.16(1.10，1.24)B 组(n=10) 727±94.5 23.7±0.67 0.464±0.048 3.60±0.267 3.11±0.0962 2.76±0.0729 1.12(1.10，1.20)C 组(n=12) 875±74.2 26.9±4.08 0.424±0.046 2.90±0.366 2.68±0.0698 2.81±0.0560 0.99(0.91，1.01)T9 A 组(n=17) 661±90.7 19.5±2.25 0.699±0.215 3.98±0.547 3.00±0.106 2.58±0.0694 1.17(1.02，1.35)B 组(n=10) 688±95.5 21.8±1.34 0.497±0.078 3.66±0.346 3.05±0.119 2.84±0.110 1.12(0.97，1.27)C 组(n=12) 835±128 27.8±3.87 0.448±0.062 2.78±0.393 2.74±0.0637 2.81±0.0961 0.98(0.92，1.03)T15 A 组(n=14) 559±119 17.7±3.25 0.759±0.245 4.71±1.134 3.02±0.116 2.45±0.100 1.15(1.08，1.38)B 组(n=8) 695±82.4 21.4±2.59 0.567±0.155 3.75±0.548 3.26±0.077 2.95±0.0733 1.10(1.03，1.15)C 组(n=12) 872±84.8 27.6±5.86 0.402±0.070 2.91±0.400 2.68±0.0513 2.77±0.0994 0.96(0.87，1.06)

2.超声心动图测量数值及比较结果 超声心动图示肺动脉高压组大鼠出现PVV 降低、AT 减少，PAID/AD、RVWT 和 RVEDD 增加，见图1。妊娠合并肺动脉高压组大鼠子宫内可见胎鼠(图2)，证实建立妊娠合并肺动脉高压模型。三组大鼠不同测量时点的超声指标见表1，三组内各时间点成对比较结果见表2，各时点三组间成对比较见表3。

表2 三组内各时点间成对P 值比较的结果

表3 各时点三组间成对P 值比较的结果

3.三组内各测量时点比较的结果及变化趋势A 组大鼠随时间的进展，其PVV 明显降低、AT 明显减少、RVWT 和 RVEDD 明显增加；B 组大鼠随妊娠天数的增加，PVV 降低、AT 减少的程度较A 组有所缓解，其 T9 较 T0 的 PV 明显降低，T9、T15 较 T0 的AT 明显减少，T9 较 T3 的 AT 明显减少，RVWT 和RVEDD 无明显差异；C 组随时间增加各测量值无明显差异(表2)。各组随时间进展超声测量指标的变化趋势不同(肺动脉瓣上流速F=10.565，P＜0.05；加速时间F=28.844，P＜0.05；右心室游离壁厚度F=6.651，P＜0.05，图3～6)。

图3 各组PVV 变化趋势；图4 各组AT 变化趋势

图5 各组PRVWT 变化趋势；图6 各组RVEDD 变化趋势

4.各测量时点三组间比较的结果 T0 时间点，三组间 PVV、AT、RVWT、RVEDD 无明显差异，而 A组、B 组较 C 组的 PAID/AD 明显增加。T3 时间点，A 组较 C 组 PVV 降低、AT 延长、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 组较 C 组 PVV 降低、RVEDD 增加、PAID/AD 升高。T9 时间点，A 组较 B 组RVEDD 增加，A 组较 C 组 PVV 降低，AT 延长、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 组较 C组的 PVV 降低、AT 延长、RVEDD 增加。T15 时间点，A 组较 B 组 PVV 降低、RVEDD 增加，A 组较 C组 PVV 降低，AT 延长、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 组较 C 组的 PVV 降低、AT 延长、PAID/AD 升高。

5.妊娠晚期股动脉和肺动脉压力的比较 三组间的 SAP 无明显差异。A 组(34.11±4.62)、B 组(28.71±4.19)较 C 组(18.45±3.01)PAP 明显升高；且B 组较A 组明显降低(图7)。

讨 论

由于妊娠合并肺动脉高压患者的生理状态不断改变，对孕妇及胎儿造成严重影响，给临床工作带来了巨大挑战[1-2]，而目前尚未有一套完整的处理流程，因此亟需大量针对此类疾病的研究。目前监测肺动脉高压的金标准是右心导管，但技术创伤大，实验动物存活率低，不利于后续观察，本研究首次采用多普勒超声来评价妊娠对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心功能的影响[3-4]，具有简便、快捷及重复性好等优势[5-8]，证实超声心动图可以代替右心导管诊断和评估肺动脉高压。

图7 各组SAP 和PAP 比较

由于肺动脉高压使右心后负荷加重，超声心动图常表现为PVV 降低，峰值前移，呈匕首状，AT 缩短，DT 延长，RVWT 增厚，RVEDD 增加，PAID 增宽，严重者可出现室间隔左移，左右心射血分数减少，右心衰竭[8]。大鼠注射野百合碱后，超声心动图出现上述典型现象，且在妊娠第18 天，直视下经右心室穿刺进入肺动脉测压显示PAP 明显增加，母鼠子宫内可见胎鼠，证实本研究成功建立妊娠合并肺动脉高压模型。

本研究发现野百合碱使大鼠右心功能不断恶化，而在妊娠后，恶化程度减轻，包括RVWT(T9)、PVV(T15)、RVEDD(T15)的恶化较单纯肺高压组明显减轻。在妊娠第18 天，妊娠合并肺动脉高压大鼠的PAP 较肺高压组降低，右心后负荷减少，导致右心功能恶化减轻，且肺动脉高压组病死率较妊娠合并肺高压组更高，证实妊娠过程对PAH 存在保护作用。在妊娠期，母体内雌激素不断增加，雌激素可通过受体启动eNOS 酶表达导致NO 合成酶增加、抑制内皮素ET-1 mRNA 的表达、促进前列环素PGI2的增加，保护和调节肺血管内皮细胞舒缩功能、促进血管扩张及抑制平滑肌细胞增殖，改善肺动脉高压中的血流动力学和气体交换[9]。故本研究结果可能与孕期雌激素的增长有关。目前研究表明外源性雌激素对肺动脉高压有保护作用。动物实验证明雌激素能抑制 PAH 的进展，对低氧或 MCT 诱导的PAH 均能起到缓解作用，改善PAH 严重程度，缓解右心室肥厚[10-12]，卵巢切除术后会使PAH 恶化[13]，且Olsson 等[14]发现雌激素可以增加右心室射血分数来治疗肺动脉高压。

Lahm 等[15]发现雌激素也能促进PAH 的发生和进展，流行病学研究发现女性PAH 患病率比男性高，但女性患者预后较好，雌激素对肺血管的保护作用与肺动脉高压患者中女性多发相矛盾[14.16]。可能是该类患者雌激素受体不足或者细胞内信号传导异常，减弱了雌激素对肺血管系统的保护作用，也可能与血栓形成有关。在妊娠期，血中雌激素的微小波动也能对血管功能产生巨大影响，雌激素对肺血管的影响较复杂且尚不明确[17]。

PAH 患者在妊娠后，出现血容量增加、心输出量增加、血管阻力降低等的生理改变[18]，大量临床资料统计显示，死亡事件多发生于终止妊娠之后，分娩后的第一周内和直到产后6 周被认为是临床上最危险的时间段，比妊娠期病死率高[17]，是否与分娩后雌激素水平下降有关不得而知。本研究结果的出现可能是在早中期雌激素的保护作用可以拮抗妊娠对心脏的冲击作用，而在晚期雌激素的保护作用不足以拮抗心脏负荷的加重。

本研究的局限性是注射野百合碱后随时间进展大鼠出现严重的肺高压，麻醉后体循环压力降低，低于肺循环压力，出现肺动脉高压危象甚至右心衰竭[17]，超声观察可见右心室显著变大，室间隔向左移动，左右心室射血减少，导致大鼠出现死亡。由于个体差异，大鼠的心率对麻醉药的反应不同导致注射野百合碱后大鼠的DT、AS 和DS 与空白组无明显差异。在之后的实验过程中，应选择合适的麻醉药及注意监测麻醉深度，减少大鼠病死率。

综上，妊娠过程对PAH 存在保护作用，可以一定程度上缓解野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心功能的恶化，为进一步研究雌激素对妊娠合并肺动脉高压患者的保护作用及雌激素的替代疗法奠定基础。