急性脑梗死患者血清中miR-15b表达变化及临床意义

黄宝和 是明启 张弘娟 黄娟

研究表明[1-2]，早期识别病因及准确预测病情变化对指导急性脑梗死患者治疗及预后改善具有重要意义。miR-15b 作为 miR-15/16 家族成员，是广泛存在于机体各系统特别是血管内皮系统中的一类miRNA，与血管内皮细胞生物学行为密切相关[3]，可通过调控血管生成相关基因表达而参与子宫内膜异位症发生[4]，有研究指出[5]，miR-15b 作为抑制血管新生分子与脑梗死后侧支循环建立相关。本研究分析急性脑梗死患者外周血中miR-15b 表达变化，探讨其与患者病情及侧支循环建立的相关性。

资料与方法

1.一般资料 选取2016年3月至2017年9月，在我院神经内科住院治疗的急性脑梗死患者165例，其中，男性 91 例，女性 74 例，年龄 34 ～78 岁，平均年龄(60.96±10.96)岁，纳入标准：①均符合《中国急性缺血性卒中诊治指南2014》中相关诊断标准；②首次发病，且入院时间距离发病在24 h 以内；③均经头部影像学检查确诊。排除标准：①复发性脑梗死；②肝肾等重要脏器严重功能障碍者；③急慢性感染、严重创伤、恶性肿瘤、自身免疫系统疾病、先天性心脏病、心力衰竭、心瓣膜病、急性心包炎、肺动脉栓塞者，以及酗酒、服用避孕药物者。同期，从体检中心选取健康体检者50 例作为对照组，其中，男性 27 例，女性 23 例，年龄 33 ～80 岁，平均年龄(60.86±14.37)岁，与病例组在性别、年龄差异无统计学意义(χ2= 0.021，P= 0.886；t= 0.743，P=0.458)，均衡可比。本研究通过医院伦理委员会批准，所有研究对象均行知情同意。

2.主要试剂与设备 Trizol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司，反转录和 PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司，miR-15b 和内参引物由上海生工生物公司设计合成，实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI公司，血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-2(Ang-2)检测试剂盒购自上海西唐生物有限公司。

3.方法 (1)神经功能缺损评分：按照美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)对急性脑梗死患者神经功能缺损程度进行评分，将患者分为三组：轻型组(＜4 分，n=72)、中型组(4 ～15 分，n=69)和重型组(＞15 分，n=24)。

(2)全脑数字减影血管造影(DSA)检查：所有脑梗死患者在签署知情同意书后，于入院5 d 时接受DSA 检查。利用德国Neurostar 公司生产的双C壁数字减影血管造影机完成检查，用改良的Seldinger 术穿刺股动脉，用5F 的Pigtail 导管先对主动脉弓进行造影，观察弓上各大血管开口情况，然后以5-F 单弯导管分别对双侧颈总动脉、锁骨下动脉选择性造影。采集速率4 帧/s，充分显示动、静脉期的血管影像。按照美国介入放射协会及神经放射介入治疗协会(ASITN/SIR)关于脑缺血后侧支血流分级标准进行分级[6]：0 级：缺血区无侧支血流；1 级：缺血区周边有缓慢的侧支血流；2 级：缺血区周边及部分缺血区可见快速侧支血流；3 级：缺血区可见缓慢的侧支血流；4 级：整个缺血区均可有快速侧支血流到达。0～1 级为侧支循环未完全组；2 ～4 级为侧支循环建立组。

(3)脑梗死体积评估：依据急性脑梗死患者MRI 影像学检查结果，按照Pullicino 法对梗死灶体积进行评估[7]，并分为小梗死组(梗死灶体积＜5 cm3)、中梗死组(5 cm3≤梗死灶体积＜10 cm3)和大梗死组(梗死灶体积≥10 cm3)。

(4)血清中miR-15b 表达水平检测：患者于入院次日和对照组于体检当日抽取空腹静脉血5 mL，1 600 r/min，离心15 min 后，留取血清，保存于-80℃冰箱以备用。按Trizol 试剂盒说明提取总RNA，检测总RNA 纯度和浓度。按逆转录试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA。使用实时荧光定量PCR仪，以cDNA 为模板用PCR 试剂盒进行引物扩增，每个样品设3 个复孔。引物序列：miR-15b：上游：5 ’-AGCAGCACATCATGGTTTAC-3 ’，下 游：5 ’-GTGCA GGGTCCGAGGT-3’； U6：上 游：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’，下游：5’-TCGGCAGCACATATACT AA-3’。PCR 条件：95 ℃ 5min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，74 ℃ 30 s，连续循环 40 次。以 U6 为内参，用 2-△△Ct法计算 miR-15b 相对表达量。

(5)酶联免疫吸附试验(ELISA 法)检测血清中VEGF 和Ang-2 浓度：取血清，利用 ELISA 法检测血清中VEGF 和Ang-2 浓度，所有操作均在标准实验室内按试剂盒说明完成。

4.统计学分析 使用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 差异有统计学意义。

结 果

1.急性脑梗死患者和对照组血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度 急性脑梗死患者血清中miR-15b 相对表达量、VEGF 和Ang-2 浓度均高于对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 急性脑梗死患者和对照组血清中miR-15b表达及VEGF、Ang-2 浓度()

表1 急性脑梗死患者和对照组血清中miR-15b表达及VEGF、Ang-2 浓度()

项目 急性脑梗死患者(n=165)对照组(n=50) t 值 P 值miR-15b 相对表达量 1.62±0.27 1.00±0.07 16.107 0.000 VEGF/(ng/L) 283.33±35.18 197.61±12.25 17.688 0.000 Ang-2/(ng/L) 41.65±7.80 24.44±2.45 15.356 0.000

2.不同侧支循环建立组患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度 侧支循环建立组患者血清中miR-15b 相对表达量低于侧支循环未完全组，而VEGF 和Ang-2 浓度高于侧支循环未完全组(P＜0.05)，见表2。

表2 不同侧支循环建立组患者血清中miR-15b表达及VEGF、Ang-2 浓度()

表2 不同侧支循环建立组患者血清中miR-15b表达及VEGF、Ang-2 浓度()

项目 侧支循环未完全组(n=67)侧支循环建立组(n=98) t 值 P 值miR-15b 相对表达量 1.93±0.12 1.57±0.10 25.197 0.000 VEGF/(ng/L) 267.94±17.22 303.35±23.96 10.396 0.000 Ang-2/(ng/L) 34.26±2.42 47.28±3.17 28.402 0.000

3.不同神经功能缺损评分患者血清中miR-15b表达及VEGF、Ang-2 浓度 与轻型组比较，中型组和重型组患者血清中miR-15b 相对表达量升高，而VEGF 和 Ang-2 浓度降低(P＜ 0.05)，与中型组比较，重型组患者血清中miR-15b 相对表达量升高，而VEGF 和 Ang-2 浓度降低(P＜0.05)，见表3。

4.不同脑梗死体积患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度 与小梗死组比较，中梗死组和大梗死组患者血清中miR-15b 相对表达量升高，而VEGF 和 Ang-2 浓度降低(P＜0.05)，与中梗死组比较，大梗死组患者血清中miR-15b 相对表达量升高，而 VEGF 和 Ang-2 浓度降低(P＜0.05)，见表4。

表3 不同神经功能缺损评分患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度()

表3 不同神经功能缺损评分患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度()

注：与轻型组比较，aP＜0.05；与中型组比较，bP＜0.05

项目 重型组(n=24) 中型组(n=69) 轻型组(n=72) F 值 P 值miR-15b 相对表达量 2.12±0.16ab 1.68±0.11a 1.40±0.08 434.937 0.000 VEGF/(ng/L) 240.07±20.85ab 274.09±23.31a 315.78±21.24 127.187 0.000 Ang-2/(ng/L) 31.87±3.29ab 36.66±2.90a 49.69±2.61 539.232 0.000

表4 不同脑梗死体积患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度()

表4 不同脑梗死体积患者血清中miR-15b 表达及VEGF、Ang-2 浓度()

注：与小梗死组比较，aP＜0.05；与中梗死组比较，bP＜0.05

项目 大梗死组(n=39) 中梗死组(n=69) 小梗死组(n=57) F 值 P 值miR-15b 相对表达量 1.91±0.15ab 1.58±0.10a 1.48±0.07 201.696 0.000 VEGF/(ng/L) 256.60±17.35ab 279.23±21.36a 316.52±19.72 107.601 0.000 Ang-2/(ng/L) 28.52±2.83ab 43.95±2.95a 56.93±3.58 1025.818 0.000

讨 论

miRNA 在血管内皮细胞增殖、凋亡、侵袭、成管等多种生物学行为中发挥重要作用[8]，同时，参与了神经系统发育及功能形成过程[9-10]。动物实验表明[11]，急性脑缺血大鼠脑组织中miRNA 表达谱改变。亦有研究指出[12]，急性脑梗死患者外周血中miRNA 表达谱发生了改变。本研究结果显示，急性脑梗死患者血清中miR-15b 相对表达量较对照组升高，说明miR-15b 可能参与了急性脑梗死发生过程。

有研究指出[13]，侧支循环建立是提高急性脑梗死患者缺血区血流灌注的关键。对减少梗死区域体积、改善患者预后及减少复发具有重要意义[14]。缺血性卒中梗死灶周围血管新生建立侧支循环涉及众多的细胞因子，包括直接介导血管新生的因子(如VEGF、内皮祖细胞和Ang)，以及间接介导血管新生的因子(如蛋白金属蛋白酶、肽类因子、人肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、低氧诱导因子-1α、转化生长因子-β1 等)[15]。VEGF 作为一种直接介导血管新生的因子，可通过促进血管内皮细胞增殖、增加血管通透性、维护血管完整性等而参与了血管生成[16]。动物实验表明[17]，VEGF 表达上调可促进脑缺血组织区新生血管形成，对缺血性卒中具有保护作用。有研究用鼠神经生长因子肌肉注射治疗急性脑梗死患者发现[18]，鼠神经生长因子可促进患者外周血中VEGF 表达，从而改善脑梗死后神经功能缺损症状。Ang-2 作为分泌型细胞因子，可与VEGF 产生协同作用，增强内皮细胞对VEGF 的敏感性，促进血管新生[19]。本研究结果显示，急性脑梗死患者血清中 VEGF 和 Ang-2 浓度升高，说明VEGF 和Ang-2 与急性脑梗死发病有关，与以往报道结果相同[20]。本研究结果显示，与侧支循环未完全组比较，侧支循环建立组患者血清中miR-15b 相对表达量降低，而VEGF 和Ang-2 浓度升高，进一步说明miR-15b 可能作为一种抑制血管生成的因子而参与了侧支循环建立过程。但由于DSA 所评估的侧支循环与VEGF 诱导生成的新生血管是否匹配还需要进一步论证，因此，miR-15b 与侧支循环建立间的关系尚待进一步研究明确。

有研究指出[21]，有侧支循环开放患者的入院时神经功能好于无侧支循环。本研究结果显示，随着神经功能缺损评分增加，患者血清中miR-15b 表达量升高，而 VEGF、Ang-2 浓度降低，说明 miR-15b 表达可能通过影响侧支循环建立而与神经功能缺损严重程度有关。本研究结果显示，随着脑梗死体积增加，患者血清中 miR-15b 相对表达量均升高，而VEGF 和Ang-2 浓度降低，说明 miR-15b 表达与脑梗死体积有关，分析原因，在缺血、缺氧状态下，继发氧化应激及炎症反应，且脑梗死体积越大、病情越重，这种反应越激烈[22]。

综上所述，miR-15b 在急性脑梗死患者血清中呈高表达，可能通过靶蛋白VEGF 而参与侧支循环建立，且与患者病情严重程度及脑梗死体积呈正相关，有望为急性脑梗死早期诊断及病情评估提供依据，但仍需要扩大样本量进一步研究。