几种深色食物中原花青素含量及抗氧化活性的测定和比较

卜得新，张方艳，朱桂兰，郭 娜，鲁红侠

（合肥师范学院生命科学学院，安徽合肥 236001）

原花青素，通常别称为缩合单宁，是类似黄酮一样的由黄烷-3-醇单体慢慢缩小合成得到的聚多酚类地物质，还具有生物活性[1]。它普遍存在于植物的叶子、皮、果食、根中[2]，尤其是深色的食物，所以研究原花青素与色泽的关系可以更好地在外观上判别食品中原花青素的含量。维C、维E是比较常见的抗氧化活性物质，但实际上原花青素比这2个的抗氧化活能力要高得多，去除人体存在的自由基效果也很好，而且能够防止因自由基导致的很多疾病，如心脏方面的疾病、关节炎等，所以它是一种很好的天然抗氧化剂[3]。因其抗氧化活性好，所以在保健品和化妆品领域中应用比较广泛。研究原花青素的抗氧化活性和测定其在食物中的含量能够更好地了解和利用原花青素来保健和预防一些疾病。

蓝莓、紫薯和巨峰葡萄这3种深色食品中含有大量的原花青素，并且蓝莓中原花青素的含量仅比公认第一的新鲜黑枸杞低一些。目前，在工业上对蓝莓、紫薯和葡萄的利用较多，在生活中这3种深色的食物也因为营养价值高而深受广大消费者的喜欢，而这三者的营养价值就是来源于其中的生物活性物质——原花青素。试验利用3种深色物质来测定其原花青素的含量，并比较三者的抗氧化性。高效液相色谱仪不但具有快速分离、极强的灵敏性和高度的自动化等方面的优势，还比一般的测定方法简单快速[4]。主要利用高效液相色谱仪来测定蓝莓、紫薯和葡萄这3种深色食物中原花青素的含量，并比较三者对超氧阴离子自由基的断根效率[5]、DPPH自由基断除效果[6]，以及OH自由基的断除效率[7]的检测，旨在为人们的生活和生产提供一定的依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓，采自合肥师范学院蓝莓基地；紫薯、巨峰葡萄，购买于禹州华侨城谊品生鲜超市。

原花青素标准品（＞98%）、甲醇试剂（色谱纯）、磷酸（色谱纯）、甲醇、无水乙醇、邻苯三酚、双蒸水、Tris-HCl（pH值8.2）、DPPH试剂、过氧化氢、水杨酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-1260型安捷伦高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司产品；LGJ-10型真空冷冻干燥机，北京松原华兴科技发展有限公司产品；722S型分光光度计、FA1104N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；80-1型离心机，杰瑞尔电器有限公司产品；HH-S型恒温水浴锅，国胜实验仪器厂产品；CR-400型色差仪，柯尼卡美达能中国投资有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料的预处理[8-15]

取新鲜的蓝莓、紫薯和巨峰葡萄，将3种深色食物进行清洗，葡萄去籽，再将3种深色食物放入搅碎机中分别搅碎，将搅碎后的样品放入低温冷冻冰箱预冷20 h，最后利用真空冷冻干燥机对样品干燥48 h后留着备用。

称取2 g样品放在50 mL的棕色容量瓶中，加入30 mL的甲醇，利用超声提取20 min，冷却至室温，再用甲醇定容到50 mL，以转速3 000 r/min离心10 min，重复2次，取上清液留着备用[4]。

1.3.2 原花青素标准曲线的制备

称取10 mg（精确到0.01 mg） 原花青素的标准品，放在10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并且定容至10 mL刻度线，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准溶液。精确的吸取标准溶液0，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容到刻度线，摇晃均匀。然后各个质量浓度吸取1.0 mL进行反应，以样品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标制备标准曲线，做出回归方程进行计算[4，16]。最后将3种样品上机操作，调节合适的色谱条件，根据高效液相色谱仪出的色谱图上对应的峰面积代入回归方程，即可求出3种样品中原花青素的含量。

1.3.3 原花青素含量的测定

精确调节色谱条件如下：耐低pH型C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）[17]，柱温30℃，流动相为甲醇-0.3%磷酸（27∶73，V/V）[4]，流速1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长525 nm，将3种样品进机操作，测出峰面积带入标准曲线方程中计算出三者含量。

1.3.4 对超氧阴离子自由基的检测

先将质量浓度为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3种样品溶液放到有刻度的试管里，再加入5 mL Tris-HCl（pH值8.2） 缓冲液，用双蒸水定容至9.7 mL，放于25℃条件下水浴保温20 min，加到25℃预热0.3 mL的浓度为3 mmol/L邻苯三酚溶液中，于波长320 nm处每隔60 s测定吸光度1次，共测9 min[18]。计算3种待测溶液吸光度随时间的变化率Fx。以1 mL蒸馏水代替上述过程中的3种待测溶液，计算出空白对照溶液吸光度随时间的变化率F0。按下列公式计算超氧阴离子自由基清除能力[5]。

公式：F0——空白对照溶液的吸光度随时间的变化率；

Fx——样品溶液的吸光度随时间的变化率。

1.3.5 DPPH自由基清除率的检验

分别吸取2.5 mL质量浓度为0.01，0.02，0.05，0.08，0.10 mg/mL样品提取液与比色管中，加入2.5 mL浓度为0.2 mmol/L DPPH溶液充分混匀，反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度Ai，另外各取2.5 mL的上述质量浓度样品提取液与比色管中，加入2.5 mL无水乙醇混匀，测其吸光度Ab，另取2.5 mL DPPH溶液与2.5 mL无水乙醇反应做参比，记录其吸光度为Ac，同时测定维C对DPPH自由基清除率作为对比。

公式：Ai——样品与DPPH混合液的吸光度；

Ab——样品溶液与无水乙醇混合液的吸光度；Ac——无水乙醇与DPPH混合液的吸光度。

1.3.6 OH自由基清除率的测定

分别吸取质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL各1 mL的3种样品溶液中依次加入3 mL浓度为7.5 mmol/L FeSO4，3 mL质量分数1%H2O2摇匀后加入3 mL浓度为6 mmol/L水杨酸，摇匀并在37℃的水浴锅中加热15 min，于波长510 nm处测定其吸光度Ay，再利用体积分数50%的乙醇代替H2O2溶液，加入上述溶液并用相同的方法测定吸光度为Am，再利用体积分数50%的乙醇代替样品溶液，测出吸光度为A0；最后用下列的公式计算OH自由基的清除率。

式中：A0——空白样品对照吸光度；

Ay——加待测样品吸光度；

Am——代替H2O2溶液测定的吸光度。

2 结果与分析

2.1 原花青素标准曲线

原花青素标准曲线见图1。

图1 原花青素标准曲线

由图1可知，标准曲线的线性关系式为Y=4 548.957 06X+8.410 72，R2=0.995 18相关性良好。

2.2 3种样品中原花青素测定的结果

运用高效液相色谱仪，在适当的色谱条件下，检测出紫薯样品对应的高效液相色谱图。

紫薯样品高效液相色谱图见图2，巨峰葡萄样品高效液相色谱图见图3，蓝莓样品高效液相色谱图见图4。

图2 紫薯样品高效液相色谱图

图3 巨峰葡萄样品高效液相色谱图

图4 蓝莓样品高效液相色谱图

由图2可知，样品所对应峰面积为Y=1 974.167 4，将其带入关系式Y=4 548.957 06X+8.410 72中，可以得出X=0.432 mg/mL。所以，样品紫薯中原花青素的质量浓度为0.432 mg/mL。利用同种方法根据图3和图4的数据可以测出巨峰葡萄和蓝莓样品中的原花青素分别为0.128，0.726 mg/mL。由数据可知，蓝莓样品提取液中的原花青素含量最高，其次是紫薯样品中的原花青素，原花青素含量最低的是巨峰葡萄样品。经查看相关资料[3]可知，蓝莓原花青素存在于整个果实中，且含量很高，紫薯果皮中含有大量原花青素，但是果肉中淀粉含量很高，原花青素含量不高，所以整体没有蓝莓原花青素含量高，巨峰葡萄的原花青素主要存在于果皮中，果肉中大部分为多糖和水分，所以与蓝莓和紫薯比较起来，巨峰葡萄中的原花青素含量最低。

2.3 对超氧阴离子自由基清除率测定的结果

3种深色样品中原花青素对超氧阴离子断根结果见图5。

图5 3种深色样品中原花青素对超氧阴离子断根结果

由图5可知，在质量浓度为0.02 mg/mL时3种原花青素提取液对超氧阴离子的去除率最小，并且随着质量浓度的增大，整个图像呈现上升的趋势，达到最大清除率的原花青素含量是0.1 mg/mL。相关研究表明，在碱性环境下，邻苯三酚本身会产生氧化反应生成超氧阴离子，与原花青素产生相合，并且随着原花青素质量浓度的升高，对产生的超氧阴离子的断除效率也提升；原花青素的样品对超氧阴离子自由基的断除效率依次为蓝莓＞紫薯＞巨峰葡萄。

2.4 DPPH自由基去除率的检测结果

3种原花青素提取液对DPPH自由基清除率见图6。

由图6可知，3种深色食品中的原花青素对去除DPPH自由基的能力都好于维C，经过调查发现，原花青素去除自由基的能力比维C要强些。随着样品中原花青素的质量浓度变高，DPPH自由基的断除结果也在不断变大，说明质量浓度与DPPH自由基的去除率有一定的关系。但是，就3种样品中的原花青素做对比可以看出，三者对DPPH自由基的去除效果都相差不明显，结合误差棒可以看出，数据的不明确性很大，可能因为在测量吸光度时，对时间和温度没有把控好。相关资料表示，原花青素的稳定性与温度有关联，所以产生较大的误差，对试验结果有所偏差[7]。

图6 3种原花青素提取液对DPPH自由基清除率

2.5 OH自由基清除率的测定结果

3种不同质量浓度原花青素提取液对OH自由基清除率见图7。

图7 3种不同质量浓度原花青素提取液对OH自由基清除率

由图7可知，随着3种原花青素提取液质量浓度的增大，整个图像呈现上升的趋势，并且原花青素对OH自由基清除率的大小依次为蓝莓＞紫薯＞巨峰葡萄。相关资料表明，原花青素浓度与OH自由基的去除效果存在明显的关系，原花青素的浓度越大，对OH自由基的去除效果也就越明显。

3 结论

随着经济增长和科技的发展，在解决了粮食短缺等问题后，人们越来关注保养和健康。原花青素的抗氧化性除了可以预防许多疾病，也可以起到美容和保健的作用。试验利用生活中常见的3种深色食品为原材料提取原花青素，测定并比较其含量与抗氧化活性。结果表明，原花青素含量依次为蓝莓＞紫薯＞巨峰葡萄；原花青素质量浓度与3种自由基都存在正相关的联系，对超氧阴离子自由基和OH自由基清除能力依次为蓝莓＞紫薯＞巨峰葡萄，去除DPPH自由基的能力相近，明显比维C强。

试验提取原花青素时，因为紫薯和巨峰葡萄中分别含有大量的淀粉和多糖，所以得到提取液中不止是原花青素，并且还含有其他物质，对抗氧化活性试验有一定干扰，进而对抗氧化活性试验的结果产生了一定偏差。可以优化去除其中的淀粉和多糖，将提取液中原花青素尽可能地提取出来。