红景天苷对呋喃所致小鼠肝损伤的保护作用研究

李钇，蹇瑜璇，窦 纯，吴 璇，闫海洋，袁 媛

（吉林大学食品科学与工程学院食品质量与安全系，吉林长春 130062）

呋喃（分子式为C4H4O），是一种具有芳香味与低沸点（31℃）的小分子环状烯醚，具有高度挥发性、亲脂性且具有毒性。它容易通过生物膜，被肺或肠吸收，可在人体中引起肿瘤或癌变[1]。国际癌症研究机构将呋喃列为可能使人类致癌物质的2B组[2]。瑞典公共健康管理局和加拿大等国家的许多研究也发现了呋喃潜在的致癌危险。美国国家毒理学计划研究表明，对于多种器官，呋喃都有较强烈的致癌作用，它可以导致肝脏和肾脏损伤，造成毒性病变，并且它所造成的损伤程度与其剂量成正比。

红景天药用历史久远，最早见载于公元1200年的藏医《四部医典》中，言其“性平、味涩、善润肺、能补肾、理气养血”[3]。红景天苷是藏药红景天的主要活性成分，化学名为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，苷元为对羟基苯乙醇，即酪醇（Tyrosol）[4]。红景天苷具有多重生物学作用，如抗疲劳、抗衰老、抗缺氧作用、心脏保护作用、脑保护作用、神经保护作用、保肝护肾、抗肺损伤、皮肤保护等[5-7]。另外，也能清除自由基、抗氧化，具有抗癌和抗细胞凋亡作用、抗炎和抗毒素作用、抗骨质疏松和糖尿病作用。目前已有研究证实红景天苷对肝脏有一定的保护作用。荣黎等人[8]研究表明，红景天苷可使大鼠血清肝功指标得到改善，降低肝组织丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含量、提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 活性，减轻肝组织病理学变化。韩洪波等人[9]证实红景天苷对肾炎大鼠有治疗作用。潘志浩等人[10]建立CCl4大鼠肝损伤模型，对病鼠进行红景天灌胃处理。结果表明，红景天苷对抗肝纤维化有一定作用，能够减缓CCl4对肝脏造成的损伤。

肝脏是机体新陈代谢的中心站，是药物、氧化性毒物及体内某些代谢产物最主要的靶位点，各种物质以肝实质或非实质细胞作为靶细胞，激发细胞损伤，产生细胞坏死、凋亡、炎症、纤维化等一系列病理变化[11]。肝组织HE切片也是判断肝脏病变及健康状况的重要材料。

通过研究呋喃和红景天苷对小鼠肝脏的氧化指标丙氨酸氨基转移酶 （Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽-S转移酶（Glutathione S-transferase，GST）、MDA、SOD，以及免疫指标肿瘤坏死因子 -α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素 -6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10） 含量变化的影响，结合肝组织HE切片分析，探究红景天苷对由呋喃所致的小鼠肝损伤的保护作用，为减轻食品中呋喃在人体内产生的损害作用提出新的解决途径，从而达到提高人体健康水平的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 氧化指标测定

丙二醛（MDA）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD） 测定试剂盒、谷胱甘肽-S移换酶（GST）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒、谷草转氨酶（AST） 测定试剂盒。

1.1.2 免疫指标测定

小鼠白细胞介素6（IL-6）、小鼠白细胞介素10（IL-10）、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α） 检测试剂盒。

1.1.3 蛋白含量测定

总蛋白定量测定试剂盒（BCA），南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 其他

无菌生理盐水、玉米油、呋喃标准品（CAS：110-00-9，纯度≥99.5%）、红景天苷 （CAS：10338-51-9，纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司提供；25只Balb/c雄性小鼠，辽宁长生生物技术有限公司提供。

1.2 仪器与设备

JD200-3型万分之一电子天平，北京北德科学器材有限公司产品；RT-6000型酶标分析仪、Spx-250B-Z型37℃恒温培养箱、HH-8型数显恒温水浴锅，上海博讯有限责任公司产品；MixMax型漩涡混匀器，北京北德科学器材有限公司产品；LD5-2A型离心机，北京医用离心机厂产品；超纯水Milli-Q system高压灭菌锅；干热消毒箱；超净台。

试验耗材：1 mL灌胃装置、1 mL一次性使用无菌注射器、解剖工具、玻璃研磨器、小号鼠笼及给水瓶、移液枪等。

1.3 方法

1.3.1 试验溶液的配制

（1）空白组试剂的配制。直接取用玉米油和生理盐水。

（2） 质量浓度8 mg/mL呋喃溶液的配制。用万分之一天平准确称量0.06 g呋喃标准品，溶于15 mL玉米油中，混匀，配置成40 mg/mL的溶液，之后取2 mL质量浓度40 mg/mL的呋喃加到8 mL玉米油中，混匀，配成质量浓度8 mg/mL的溶液，以上操作全部现用现配、冰上操作。

（3） 质量浓度40 mg/mL红景天苷溶液的配制。用万分之一天平准确称量0.06 g红景天苷，溶于15 mL生理盐水中，混匀，配制成40 mg/mL的溶液。

（4） 质量浓度20 mg/mL红景天苷溶液的配制。取质量浓度40 mg/mL的红景天苷溶液，加入2倍体积的生理盐水得到质量浓度20 mg/mL的溶液。

（5）质量浓度10 mg/mL红景天苷溶液的配制。取质量浓度20 mg/mL的红景天苷溶液，加入2倍体积的生理盐水得到质量浓度10 mg/mL的溶液。

1.3.2 动物的分组

25只Balb/c雄性小鼠，体重20±3 g，随机分为5组，每组5只，分别放入5个鼠笼，在温度为18～22℃，相对湿度为50%～60%的条件下饲养。自由觅食饲养1周，待小鼠完全适应环境后，进行动物试验。所有的操作和试验流程均遵守我国《实验动物管理条例》。

小鼠适应环境后，首先将无菌小鼠随机分为5组，分别为空白组，呋喃组（8 mg/kg/d），红景天低（10 mg/kg/）、中（20 mg/kg/d）、高（40 mg/kg/d）剂量组。除空白组用玉米油灌胃外，其余各组均进行呋喃灌胃。采用上述步骤处理15 d后，在每组中随机取出1只小鼠观察病变情况，若所取小鼠均病变，则建模成功。若建模失败，除空白组外各组继续用呋喃灌胃15 d，再次检测，直到建模成功。成功后，每天要进行2次灌胃。空白组作为对照组，要求连续15 d每天上午用玉米油灌胃，下午用生理盐水灌胃；呋喃染毒组连续15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午用生理盐水灌胃；红景天苷保护组连续15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午分别用10，20，40 mg/mL的红景天苷溶液灌胃。灌胃时间为每天上午8:00-9:00，下午3:00-4:00。试验期间，每天记录小鼠的体重，并根据体重给予呋喃和红景天苷的剂量，密切观察小鼠的体型、体重、饮食习惯和日常活动的变化情况。待给药阶段完全结束后，将所有小鼠麻醉处死，取其肝脏和血液进行指标测定。

1.3.3 小鼠处理及血清的制备

试验进行30 d，最后一次给药结束，断食。12 h后处死小鼠。将小鼠麻醉后，用眼球取血法取小鼠外周血，用EP管收集。将EP管放在4℃环境中静置1～2 h，待血清析出后以转速3 000～4 000 r/min，温度4℃条件下冷冻离心10 min，吸取上层血清部分，于4℃下储存，待进一步指标分析。

1.3.4 小鼠组织匀浆的制备

用脱脊椎法处死小鼠后，立即在超净工作台上解剖取出肝脏组织，用生理盐水洗去表面血迹和杂毛，滤纸擦干后称质量。按肝脏质量∶体积=1∶9量取预冷的生理盐水，一并加入预冷的玻璃匀浆机中，冰浴研磨至无组织块，制成10%的组织匀浆。匀浆放于离心机内以转速3 000 r/min离心15 min，取上清液待测，若不澄清或澄清不彻底应再次离心。

1.3.5 小鼠氧化指标的测定

严格按照试剂盒说明测定小鼠肝组织中MDA，SOD，GSH-Px，GST的含量，以评定小鼠氧化损伤状况。按照试剂盒说明测定小鼠血清中AST，ALT的含量，结合测定结果评定小鼠肝脏的健康状况。

1.3.6 小鼠免疫指标的测定

严格按照试剂盒说明测定小鼠血清中的TNF-α，IL-6，IL-10的含量，以评定小鼠免疫功能的变化情况。

1.4 计算

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，p＜0.05为差异具有统计学意义。试验数据均使用Origin绘图软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 小鼠肝组织HE切片及分析

Furan诱导肝损伤小鼠肝组织病理学观察结果（400×） 见图1。

图1 Furan诱导肝损伤小鼠肝组织病理学观察结果（400×）

中毒等急性病理过程会导致肝脏出现空泡变性、嗜酸性变、细胞核异型性、变性坏死等病变情况，根据不同组别切片中肝脏的病变情况判断小鼠的肝脏损伤程度，从而探究红景天苷对呋喃所致肝损伤的保护作用。

空白组小鼠的肝切片出现透明泡，应为空泡变性或者脂肪变性，原因可能为空白组小鼠灌胃玉米油造成脂肪摄入过多，无法完全代谢。空白组大部分肝脏组织健康正常，无其他病变。呋喃染毒组小鼠肝脏切片显示，肝脏出现脂肪变性或空泡变性，嗜酸性变明显，炎细胞浸润现象突出，并且出现了明显的组织坏死现象，肝组织损伤情况严重。红景天苷低剂量组的小鼠肝脏有空泡变性和嗜酸性变，嗜酸性变仍较为严重，炎细胞浸润现象也十分明显，但病变情况较呋喃组相比有一定程度的减轻。红景天苷中剂量组中的小鼠肝切片嗜酸性变，伴有空泡变性和炎细胞浸润，炎细胞浸润现象仍较明显，有减轻趋势。红景天苷高剂量组小鼠肝切片的嗜酸性变明显减弱，几乎消失，炎细胞浸润明显。嗜酸性变与肝脏损伤有关，损伤程度越深，嗜酸性变得越强烈。呋喃组小鼠的肝脏损伤最强烈，红景天苷组小鼠肝脏损伤程度随红景天苷浓度增高呈降低趋势。

2.2 小鼠体内氧化指标的测定结果及分析

小鼠体内氧化指标测定结果见表1。

ALT和AST均为非特异性细胞内功能酶，是临床上常用的肝功能评价指标[12]。ALT和AST主要分布在肝细胞内，正常情况下，二者在血浆中的含量相对稳定且较低，但当肝细胞发生变性或坏死时ALT，AST含量就会升高，其升高的程度与肝细胞的受损程度相一致[13]，试验将AST，ALT这2个指标作为判断肝损伤的重要数据。由表1可知，呋喃染毒组的小鼠肝脏中AST，ALT含量明显高于空白组和红景天苷组。并且随着红景天苷浓度的升高，血清中AST和ALT的含量逐渐下降。呋喃染毒组中的AST和ALT水平高，说明呋喃导致肝细胞膜通透性改变，AST，ALT释放进入了血浆中，肝组织出现炎症、肿胀或坏死等损伤现象，而红景天苷对这一损伤有显著的保护作用，且这种保护作用随红景天苷剂量的增加而增强。

表1 小鼠体内氧化指标测定结果

GSH-Px能够催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，保护生物膜免受ROS的损害。它还具有保护肝脏、提高机体免疫力的功能。GST是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。二者含量的下降表明肝脏解毒和抗氧化损伤能力下降，肝脏受损。由表1数据计算得，呋喃染毒组的GSH-Px与空白对照组相比下降了47.80%，GST水平下降了57.17%，红景天苷保护组的GSH-Px和GST水平较呋喃染毒组有所回升，并且回升程度与红景天剂量有关。因此，红景天苷可以通过增加肝脏中GSH-Px，GST的水平，增加生物体抗氧化和解毒的能力，改善由呋喃引起的肝脏氧化损伤。

自由基可与肝细胞内的蛋白质等大分子进行共价结合，干扰蛋白质的合成，也可与肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，导致肝细胞内SOD过度消耗，MDA大量产生，同时破坏肝细胞膜结构和功能的完整性，使膜通透性升高，导致肝细胞肿胀坏死，肝细胞破损后释放ALT，AST渗入血液而活性升高[14-16]。自由基是导致机体氧化损伤的直接原因。MDA为脂质过氧化的产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀坏死。它既能反映体内氧化反应，也可以作为损害因子对机体造成损伤[17]，因此测定肝脏中MDA的量可以反映出机体氧化损伤的程度。SOD是生物体内重要的活性物质，能够清除机体内的自由基。SOD首先催化超氧阴离子生成氧气和过氧化氢，生成的过氧化氢在GSH-Px的催化下转换成H2O和O2[18]。SOD能够保护细胞免受损伤，间接地反映了机体清除体内氧自由基的能力[19]。由表1可知，呋喃染毒组和红景天苷保护组的SOD水平显著低于对照组，MDA水平高于对照组，这说明呋喃使小鼠肝脏受到了一定程度的氧化损伤。在红景天苷的作用下，小鼠肝脏内的SOD水平有所回升，红景天苷低剂量组中的SOD比染毒组上升了32.83%，红景天苷中剂量组中的SOD比染毒组上升了54.08%，红景天苷高剂量组中的SOD比染毒组上升了102.37%。由此可见，红景天苷可以通过显著提高肝脏中SOD的水平来清除增多的氧自由基，减缓呋喃引起的肝脏的氧化损伤，且保护作用与红景天苷剂量呈正相关。呋喃组MDA水平高，脂质过氧化程度增加，肝脏受损。红景天苷处理后，肝脏MDA浓度显著降低，且呈现了与剂量的正相关，说明红景天苷处理可以有效改善呋喃导致的肝损伤。

2.3 小鼠体内免疫指标的测定结果和分析

小鼠血清中TNF-α的含量变化见图2，小鼠血清中IL-6的含量变化见图3，小鼠血清中IL-10的含量变化见图4。

图2 小鼠血清中TNF-α的含量变化

图3 小鼠血清中IL-6的含量变化

图4 小鼠血清中IL-10的含量变化

在肝脏损伤的过程中炎症被激活是一种常见的病理生理过程[20]。TNF-α，IL-6是重要的免疫反应调节因子。TNF-α是一种由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子，具有促炎作用[21]，是多种信号通路的关键环节。IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。IL-10是由活化的免疫细胞产生的关键抗炎细胞因子[22]，肝脏中许多细胞都能分泌IL-10，其具有消除炎症的作用[23]。

由图2和图3可知，呋喃染毒组血清中TNF-α，IL-6含量与空白对照组相比，有显著性增加（p＜0.05）；说明呋喃刺激小鼠产生免疫反应，对小鼠机体有一定毒害作用。红景天苷相关剂量组中TNF-α，IL-6含量与呋喃组相比，有显著性减少（p＜0.05），减少程度与红景天苷剂量成正比。这说明红景天苷对小鼠血清中TNF-α，IL-6分泌有明显抑制作用，且抑制作用随着剂量增高而增强，即红景天苷能够抑制呋喃引发的免疫反应。由图4可知，IL-10作为炎症与免疫抑制因子，在呋喃染毒组的含量远远低于空白组，给予了不同剂量的红景天苷后，呋喃染毒组的含量上升，说明呋喃可以引发机体炎症，而红景天苷可以通过抑制促炎因子、提高体内炎症抑制因子的分泌来调节机体免疫，清除呋喃的损伤作用。

3 结论

作为食品加工过程中产生的污染物，呋喃具有潜在的致癌性。通过小鼠的肝脏HE切片可知，呋喃的作用能够使小鼠肝脏发生氧化损伤，主要表现为肝细胞空泡变性、嗜酸性变、空化、炎细胞浸润和细胞核异型性，少部分肝脏可能出现组织坏死的现象。给予红景天苷的小鼠，肝脏的病变情况减轻，且减轻程度与红景天苷剂量呈正相关趋势。这说明红景天苷能在一定程度上减少呋喃使肝脏发生的病理性损伤。同时呋喃导致小鼠机体内AST，ALT，MDA含量升高，SOD，GSH-Px，GST含量下降，说明呋喃会引发小鼠肝脏的氧化损伤，相关抗氧化酶活力降低，清除自由基效率明显下降。而红景天苷各剂量组的小鼠中AST，ALT，MDA水平低于呋喃组，SOD，GSH-Px，GST含量有所回升，表明红景天苷可以减少肝细胞膜通透性的改变，有效提高了肝脏组织内清除自由基的能力，减少肝脏的氧化损伤。

免疫指标TNF-α，IL-6，IL-10的变化反映肝脏的免疫状态。TNF-α，IL-6是重要的免疫反应调节因子。含量越高，免疫强度越大，肝脏受损伤越严重。IL-10是重要的炎症与免疫抑制因子，含量越低，机体抵抗炎症侵袭的能力越弱，免疫能力越低下，受损伤越严重。呋喃组小鼠血清中TNF-α，IL-6含量显著高于空白组，而IL-10含量远远低于空白组，呋喃导致小鼠肝脏受损较严重。然而红景天苷灌胃小鼠后能明显抑制淋巴因子TNF-α，IL-6的分泌，促进IL-10的分泌，从而表现出红景天苷具有明显调节和增强机体免疫力的功能。

小鼠肝脏组织切片、氧化指标、免疫指标为一个整体，由脏器到分子水平提示红景天苷对呋喃导致的小鼠肝损伤有一定的保护作用，并且这种保护作用和红景天苷的剂量呈正相关关系。红景天苷可能通过提高机体抗氧化酶活性，减轻自由基对细胞膜造成的损伤，同时也有试验结果表明红景天苷可以调节机体的免疫反应，因此红景天苷对由呋喃引发小鼠肝损伤的保护作用可能是通过多条途径实现的。