滋补脾阴方药对脾阴虚大鼠空肠组织黏蛋白表达的影响

侯圣林 战丽彬 孙晓霞

摘要：目的  观察滋补脾阴方药对脾阴虚大鼠空肠组织黏蛋白（MUC）表达的影响，探讨其相关作用机制。方法  将大鼠随机分为正常对照组、模型组和滋补脾阴方药组。采用复合方法建立脾阴虚证动物模型，连续38 d，滋补脾阴方药组于造模第25～38日予滋补脾阴方药药液灌胃，正常对照组和模型组予生理盐水灌胃。免疫组化观察大鼠空肠组织MUC的表达。结果  与正常对照组比较，模型组大鼠空肠组织MUC2蛋白表达有降低趋势，MUC3和MUC5AC蛋白表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较，滋补脾阴方药组大鼠MUC2蛋白表达有上调趋势，MUC3蛋白表达明显降低（P<0.001），MUC5AC蛋白表达有下调趋势。结论  滋补脾阴方药可改善脾阴虚模型大鼠MUC的表达。

关键词：脾阴虚;滋补脾阴方药;黏蛋白;空肠;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）08-0051-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.011      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Zibu Piyin Recipe on MUC expression in rats with spleen-yin deficiency; To discuss the relevant mechanism of action. Methods The rats were randomly divided into normal control group， model group and Zibu Piyin Recipe group. The animal model of spleen-yin deficiency syndrome was established by compound method for 38 days. Zibu Piyin Recipe group was given Zibu Piyin Recipe for gavage during d25-d38 of modeling， the normal control group and the model group were given nornal saline for gavage. The expression of MUC of colon tissues was observed by immunohistochemistry. Results Compared with the normal control group， the expression of MUC2 protein in the model group was has a downward trend， and the expressions of MUC3 and MUC5AC protein increased （P<0.05）. Compared with the model group， the expression of MUC2 protein in Zibu Piyin Recipe group was has an upward trend. Expression of MUC3 protein was significantly decreased （P<0.001）， and expression of MUC5AC protein was has a downward trend. Conclusion Zibu Piyin Recipe can improve the MUC expression of spleen-yin deficiency model rats.

Keywords： spleen-yin deficiency syndrome; Zibu Piyin Recipe; mucin; jejunum; rats

中醫学理论认为，脾的功能为运化水谷、输布水液和精微物质，又具有统摄血液的作用，故“脾为后天之本”。脾阴虚的病理变化表现在运化失司、营阴不足、阴虚内热等。脾的生理功能会直接影响机体防御疾病的能力，因而有“脾主为卫，脾虚则百病内生”的说法[1]。黏蛋白（mucin，MUC）广泛存在于消化道，维持黏液保护层厚度及胶体形态，润滑肠道，在胃肠黏膜的防御和修复过程中扮演着重要角色。胃肠黏膜的防御屏障机制与中医的“脾主为卫”有着相同生理病理基础。这种联系表明胃肠黏膜的防御功能减弱可能与脾胃生理功能减退有关。提示脾胃的防卫功能不仅与全身免疫功能有关，而且与胃肠黏膜本身的防御屏障功能有关。因此，本实验观察滋补脾阴方药对脾阴虚大鼠空肠MUC2、MUC3和MUC5AC蛋白表达的影响，探讨其相关作用机制。

1  材料与方法

1.1  动物

健康Wistar雄性大鼠18只，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于南京中医药大学SPF级动物房，室温18～23 ℃，相对湿度45%～55%，明暗12 h交替。

1.2  药物

滋补脾阴方药（红参30 g，莲肉20 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白扁豆15 g，丹参12 g，石菖蒲10 g，远志10 g，檀香4.5 g，橘红9 g，炙甘草9 g），饮片购于大连医药集团药材公司，常规水煎，每毫升药液含原药材3.29 g，过滤后4 ℃冰箱保存备用。伤阴药（制附子、吴茱萸、肉桂按1∶1∶1混合），饮片购于南京中医药大学国医堂，常规水煎，每毫升药液含原药材1 g，过滤后4 ℃冰箱保存备用。

1.3  主要试剂与仪器

MUC（MUC2、MUC3、MUC5AC）免疫组化试剂盒（美国Abcam公司）。AC8洗板机（美国Thermo Labsystem公司），ASP300S全自动真空组织脱水机（德国Leica公司），Image Pro Plus 5.0.2免疫组化图像分析软件。

1.4  分组、造模及给药

18只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、脾虚模型组。适应性喂养3 d，自由摄食饮水。采用复合因素（饮食不节、劳倦过度与耗伤阴液等）方法建立脾阴虚模型[2]。脾气虚模型阶段：采用饮食不节与力竭游泳相结合的方式，即先饱食1 d，再禁食2 d，3 d为1个循环，实验期间自由饮水;每日1次，水温保持22 ℃游泳至力竭，连续14 d。脾阴虚模型阶段：第15日，将脾气虚证造模成功大鼠每日增加伤阴药药液1 mL/100 g灌胃。正常对照组予等体积生理盐水灌胃。滋补脾阴给药阶段：第25～38日将脾阴虚模型组分为模型组和滋补脾阴方药组，其中滋补脾阴方药组每日予滋补脾阴方药药液1 mL/100 g灌胃，正常对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每日详细记录大鼠体质量、肛温、饮水量及进食量，并观察大鼠粪便及毛发色泽等。

1.5  模型评估

参考《中医虚证辨证参考标准》[3]及《中医新药临床研究指导原则（试行）》[4]。在脾气虚造模状态下，大鼠出现食少、消瘦、神疲乏力、毛色枯槁无光泽，便溏或软，并且游泳耐力下降，表明脾气虚模型建立成功。脾阴虚造模状态下，大鼠出现体质量下降、易暴躁、易激怒、时有咬斗、肛温升高、粪便干燥、毛发枯槁无光泽、进食量时增时减和饮水量增多等现象，表明脾阴虚模型建立成功。

1.6  标本制备

末次给药后，2%戊巴比妥钠麻醉，大鼠腹主动脉取血，冰上迅速摘取空肠组织，分成50～100 mg小块，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。

1.7  免疫组化检测空肠组织黏蛋白表达

按免疫组化试剂盒说明书进行操作。实验步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗2次×5 min，抗原修复。用蒸馏水或PBS配制新鲜3%H2O2，室温封闭10 min，蒸馏水洗1次。PBS冲洗5 min，滴加5%牛奶封闭液，室温10 min。甩去多余液体，滴加一抗，4 ℃过夜（过夜后37 ℃复温45 min）。PBS洗2次×5 min，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min。PBS洗2次×5 min，滴加適当比例稀释的辣根酶标记链霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min。PBS洗2次×5 min，DAB显色3～10 min，镜下观察染色程度。蒸馏水冲洗终止染色，苏木素复染2 min。分化后透明、封片，待镜检。

1.8  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据用—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

免疫组化检测结果显示，大鼠空肠组织棕黄色区域为MUC阳性表达（见图1～图3）。与正常对照组比较，模型组大鼠MUC2蛋白表达有降低趋势，MUC3和MUC5AC蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，滋补脾阴方药组大鼠MUC2蛋白表达有上调趋势，MUC3蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.001），MUC5AC蛋白表达有下调趋势。见表1。

3  讨论

脾为“仓廪之官”“后天之本”，机体很多疾病的产生都与脾虚有一定联系。脾为五脏六腑之本，脾失健运，不能运化水谷精微，提示机体处于脾虚状态时，机体胃肠黏膜防御功能下降。现代研究认为，脾是以消化系统为基础的，包括能量代谢与水液代谢，并与血液、内分泌、免疫和神经系统等有着密切联系的一个医学概念，是一个多系统、多器官的功能单位。有研究者认为，脾虚涵盖了机体多个系统以及系统的多个功能的异常，其主要特征是消化系统形态与功能的异常[5]。脾为太阴，乃三阴之长，脾阴是指藏于脾中的由水谷精微所化生的营血津液等精微物质，是人体阴液的一部分，也是脾脏功能活动的物质基础。脾阴生理功能主要表现在运化濡养、统摄血液和制约阳热等方面，脾阴病理表现主要包括运化失司、阴虚内热、营阴不足等。其主要症状为：食少腹胀，食后尤甚，大便溏薄或秘结、溏结不调，口干舌燥，形体消瘦，面色无华，倦怠乏力，手足心热，舌红少津，苔少或无，脉细无力[6]。滋补脾阴方药是战丽彬教授在《不居集》资成汤基础上结合自身多年临床实践化裁而成[7]，方中人参补益脾气以助脾阴，山药培补脾元，白扁豆、茯神滋阴补脾，白芍柔肝健脾，佐以莲肉、丹参交通心肾。全方以培补后天、滋补脾阴为立方原则，所含药物具有质地濡润、生津化液、补而不燥、滋而不腻、守中化阴、不碍升运的特点。

MUC主要存在于胃肠道、乳腺、胰腺上皮细胞中，是由杯状上皮细胞合成分泌的大分子量糖蛋白，至今已发现21种MU。根据MUC不同的功能或特点可分为不同种类，依据其生理学特点可分为膜结合型、分泌型、可溶性MUC。这3种MUC主要区别在于是否具有跨膜区。膜结合型MUC主要分布在细胞表面或胃肠上皮黏液中，MUC3存在于跨膜区、胞质尾区和广泛的胞外区。分泌型MUC多由凝胶形式存在，MUC2、MUC5AC形成低聚物结构。可溶性MUC属非凝胶形式MUC。MUC具有多种功能，结构不同所具有的功能也不尽相同。MUC2主要存在结肠、空肠中，是肠道黏液的组成部分。MUC3是由小肠、结肠绒毛上皮细胞分泌的，是一种跨膜MUC。MUC5AC主要表达于胃黏膜，目前研究发现在一些病理情况下也会表达于肠黏膜[8]。MUC对肠黏膜上皮具有保护作用，在肠道黏膜防御中发挥积极作用，同时，MUC分泌本身还可起到润滑作用[9]。

本实验结果表明，模型组大鼠较正常对照组空肠组织MUC2蛋白表达有下调趋势，滋补脾阴方药组空肠组织MUC2蛋白表达有上调趋势;模型组大鼠空肠组织MUC3和MUC5AC蛋白均有明显表达，滋补脾阴方药组空肠组织MUC3蛋白表达较模型组明显降低，MUC5AC蛋白表达也有下调趋势。

综上所述，脾阴虚狀态下，空肠黏膜分泌MUC2出现下降趋势，空肠黏膜分泌MUC3、MUC5AC增加，经滋补脾阴方药治疗后，MUC2分泌又出现增加趋势，MUC3表达明显降低，MUC5AC表达也出现下调趋势。这提示滋补脾阴方药可能有改善脾阴虚大鼠空肠黏膜的屏障作用。

参考文献：

[1] 张博.脾虚大鼠肠黏膜屏障功能变化及四君子汤对其影响的实验研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2014.

[2] 战丽彬，刘莉，宫晓洋，等.脾阴虚痴呆证病结合模型建立及滋补脾阴方药干预的实验研究[J].中华中医药学刊，2008，26（1）：9-12.

[3] 沈自尹，王文健.中医虚证辨证参考标准[J].中西医结合杂志，1986， 6（10）：598-600.

[4] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[M].北京：中国医药科技出版社，2002：354-355.

[5] 刘晓玲.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜TFF1表达及MEK/ERK通路的影响[D].广州：广州中医药大学，2011.

[6] 王忆勤.中医诊断学[M].北京：中国中医药出版社，2004：164.

[7] 胡守玉，梁丽娜，战丽彬，等.滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质内质网应激的影响[J].中国中医药信息杂志，2014，21（1）：46-49，53.

[8] 于秀文，赵春明，胡南.粘蛋白MUC2、MUC5AC在大肠腺癌中的表达及意义[J].中国医疗前沿，2013，8（7）：26-27.

[9] SHEKELS L L， HO S B. Characterization of the mouse Muc3 membrane bound intestinal mucin 5 coding and promoter regions： regulation by inflammatory cytokines[J]. Biochim Biophys Acta，2003， 627（2/3）：90-100.

（收稿日期：2018-12-22）

（修回日期：2019-01-15;编辑：华强）